白藜蘆醇對過氧化氫誘導(dǎo)的原代脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性的保護(hù)作用.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病以阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）、肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和帕金森?。≒arkinson disease，PD）為代表，其病因?qū)W和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，而臨床上又無有效控制病程進(jìn)展的措施，找到一關(guān)鍵的治療靶點(diǎn)和有效藥物極為重要。
　　 星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes）在多種神經(jīng)變性疾病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵性作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞的

2、反應(yīng)性增生是共同的病理特點(diǎn)。正常情況下星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放營養(yǎng)因子和清除突觸間隙的谷氨酸，支持和保護(hù)運(yùn)動神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后，其形態(tài)功能改變，以及它與運(yùn)動神經(jīng)元的相互作用發(fā)生紊亂，導(dǎo)致了運(yùn)動神經(jīng)元的死亡，加速疾病進(jìn)展。星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)變性疾病的重要治療靶點(diǎn)。
　　 機(jī)體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生和清除失去平衡，導(dǎo)致ROS在體內(nèi)大量蓄積，產(chǎn)生氧化應(yīng)激。當(dāng)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體失表達(dá)或反向釋放

3、谷氨酸時，引起突觸間隙或胞外谷氨酸大量蓄積從而導(dǎo)致神經(jīng)毒性反應(yīng)。多種神經(jīng)變性疾病，都與氧化應(yīng)激和谷氨酸興奮性毒性密切相關(guān)。
　　 近來文獻(xiàn)報道，Nrf2/ARE信號通路的激活可在多種組織中誘導(dǎo)一系列內(nèi)源性的細(xì)胞保護(hù)基因上調(diào)，其中包括抗氧化酶、抗氧化蛋白、抗炎和解毒的蛋白。這些抗氧化酶和抗氧化蛋白在神經(jīng)組織中的表達(dá)增加，可對抗由谷氨酸、過氧化氫及多巴胺引起的氧化損傷。因此Nrf2/ARE信號通路的激活有望成為神經(jīng)變性疾病治療的新靶

4、點(diǎn)。
　　 白藜蘆醇（resveratrol）是在葡萄的皮和種子中提取的一種植物抗毒素，其具有多種生物學(xué)活性：如抗氧化作用，神經(jīng)保護(hù)作用，拮抗腫瘤增殖作用，心血管保護(hù)作用，激活延壽基因等作用。研究證實(shí)，白藜蘆醇上述生物學(xué)活性中，最受關(guān)注的是抗氧化清除自由基和神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 本研究應(yīng)用過氧化氫，利用脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)建立細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，并以此為基礎(chǔ)，深入研究白藜蘆醇對過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的保護(hù)作用。以抗氧化

5、和抗興奮性毒性為切入點(diǎn)，觀察白藜蘆醇的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 目的：利用原代小鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)，并應(yīng)用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，模型建立后進(jìn)行白藜蘆醇藥物干預(yù)，觀察其干預(yù)后在抗氧化方面Nrf2/ARE通路下游經(jīng)典抗氧化酶NQO1和GST以及核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2總蛋白表達(dá)、totalNrf2 mRNA水平，細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量，以及細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（ROS）的熒光強(qiáng)度差異。

6、在抗興奮性毒性方面研究谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT1和EAAT2的蛋白表達(dá)以及培養(yǎng)液中谷氨酸含量的變化，探討白藜蘆醇在星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激條件下發(fā)揮的保護(hù)作用。
　　 方法：選用生后1-2天的ICR乳鼠脊髓組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，正常培養(yǎng)兩周后進(jìn)行純化、傳代，取第三代細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗分為三組：正常對照組，模型組，藥物干預(yù)組。對照組為單純培養(yǎng)液，模型組加入25uM H2O2作用1小時，干預(yù)組先加入15uM白藜蘆醇預(yù)處理24小時，再加入25uM

7、H2O2作用1小時。分別收集各組的細(xì)胞培養(yǎng)液，進(jìn)行乳酸脫氫酶（LDH）和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）以及谷氨酸（glutamate）含量的測定。利用Western blot方法，檢測NQO1、GST、核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2總蛋白以及谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT1和EAAT2的的蛋白表達(dá)變化。應(yīng)用RT-PCR檢測白藜蘆醇對正常星形膠質(zhì)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 mRNA的表達(dá)水平作用。利用激光共聚焦檢測各組中星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（ROS）的熒光強(qiáng)度差

8、異。
　　 結(jié)果：
　　 （1）模型組細(xì)胞在H2O2處理1小時后，NQO1，GST、totalNrf2蛋白表達(dá)較對照組明顯降低（P<0.01）。白藜蘆醇預(yù)處理后能夠?qū)笻2O2對細(xì)胞的氧化損害，干預(yù)組NQO1、GST、total Nrf2蛋白表達(dá)水平與模型組相比明顯增高（P<0.05）
　　 （2）白藜蘆醇作用24小時后，Nrf2的mRNA水平和正常對照組相比能明顯增高（P<0.05）。
　　 （3）H2

9、O2處理1小時后，培養(yǎng)液中LDH含量較對照組明顯升高（P<0.05），白藜蘆醇預(yù)處理后LDH含量較模型組明顯降低（P<0.05）。
　　 （4）細(xì)胞在H2O2處理1小時后，培養(yǎng)液中MDA含量較對照組明顯升高（P<0.05），白藜蘆醇預(yù)處理后能對抗H2O2對細(xì)胞的損害，MDA含量較模型組明顯降低（P<0.01）。
　　 （5）H2O2處理1小時后，星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（ROS）熒光強(qiáng)度較對照組明顯升高（P<0.05），白

10、藜蘆醇預(yù)處理后細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（ROS）熒光強(qiáng)度較H2O2組明顯降低（P<0.01）。
　　 （6）星形膠質(zhì)細(xì)胞在H2O2處理1小時后，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT1和EAAT2蛋白表達(dá)較對照組明顯降低（P<0.01），白藜蘆醇預(yù)處理后干預(yù)組EAAT1和EAAT2蛋白表達(dá)水平與模型組相比明顯增高（P<0.05）。白藜蘆醇作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞24小時，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT1和EAAT2蛋白表達(dá)水平和正常對照組相比也能明顯增高（P<0.05）。

11、
　　 （7）H2O2處理1小時后，培養(yǎng)液中谷氨酸含量較對照組明顯升高（P<0.01），白藜蘆醇預(yù)處理后能對抗H2O2對細(xì)胞的損害，減少谷氨酸的釋放增加其轉(zhuǎn)運(yùn)，培養(yǎng)液中谷氨酸含量較H2O2組明顯降低（P<0.05）。
　　 結(jié)論：原代培養(yǎng)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后，細(xì)胞發(fā)生氧化損害，細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS產(chǎn)生增加，Ⅱ相解毒酶：NQO1和GST、總Nrf2、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT1和EAAT2的蛋白表達(dá)較正常對照組下降，培

12、養(yǎng)液中LDH、MDA和谷氨酸含量較正常對照組明顯升高。給予白藜蘆醇預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后，清除細(xì)胞內(nèi)ROS，干預(yù)組Ⅱ相解毒酶：NQO1和GST、總Nrf2、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT1和EAAT2的蛋白表達(dá)較模型組升高，培養(yǎng)液中LDH、MDA和谷氨酸含量較模型組降低，并且白藜蘆醇能夠上調(diào)總Nrf2的mRNA表達(dá)水平和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT1和EAAT2的蛋白表達(dá)水平。本研究證實(shí)了白藜蘆醇能夠通過抗氧化和抗興奮性毒性來發(fā)揮對星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷的保