金絲桃苷對過氧化氫誘導(dǎo)的L02細胞損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、目前，病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、缺血-再灌注肝損傷、藥物性肝病、肝癌等肝臟疾病已成為世界公共健康問題。研究證實，氧化應(yīng)激通過影響酶類及受體的功能，破壞細胞膜完整性，影響細胞保護基因的表達，干擾肝臟的氧化-還原穩(wěn)態(tài)，從而參與多種肝臟疾病的病理生理過程。氧化應(yīng)激損傷臨床常采用維生素A、β-胡蘿卜素、維生素E、維生素C、GSH等還原性物質(zhì)進行抗氧化治療。但近年發(fā)現(xiàn)，NO、H2O2等多種自由基是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，化學(xué)藥物在

2、清除過量有害自由基的同時亦會影響自由基作為信號分子的正常生理功能。因此，尋找增強肝細胞內(nèi)源性抗氧化能力，促進氧化-還原穩(wěn)態(tài)恢復(fù)的藥物，有望成為氧化性肝損傷的有效治療手段。
　　研究顯示，Keap1-Nrf2-ARE信號通路參與氧化性肝損傷修復(fù)過程中細胞保護基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。由于該信號通路具有調(diào)節(jié)細胞內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的特點，研究該通路的誘導(dǎo)劑，有望為實現(xiàn)適度、可控的氧化性肝損傷治療開辟新的途徑。
　　植物黃酮能顯著抑制病毒性肝炎

3、、藥物性肝病、肝癌等的發(fā)生發(fā)展，其機制可能與激活Keap1-Nrf2-ARE信號通路增強細胞內(nèi)源性抗氧化能力有關(guān)，但其作用靶點尚待進一步闡明。金絲桃苷(Hyperoside，Hyp)屬黃酮醇苷化合物，對缺血性腦損傷、心肌損傷、肝損傷及腎損傷均有顯著保護效應(yīng)，其機制主要為抗氧化。既往研究表明，Hyp除能直接清除ROS、螯合金屬離子外，還可能增加GSH-Px、SOD、CAT等抗氧酶的活性，但對酶活性的這種調(diào)節(jié)作用是否是通過調(diào)控抗氧化基因的表

4、達實現(xiàn)的，尚未明確。
　　本研究擬以H2O2損傷的L02細胞為模型，在明確Hyp肝細胞保護效應(yīng)的基礎(chǔ)上，分析抗氧化酶活性增加與基因表達的關(guān)系，探討Keap1-Nrf2-ARE信號通路在其中的調(diào)控作用。
　　研究內(nèi)容：
　　1、建立測定L02細胞內(nèi)外Hyp含量的HPLC方法，分別于加藥后0,3,6,12,24 h分析細胞內(nèi)外Hyp的含量。
　　2、建立H2O2(100μM,6 h)損傷的L02細胞模型，測定細胞活力

5、、LDH泄漏百分比、MMP、ROS清除能力和抗氧化酶SOD、HO-1的活性，分析Hyp肝細胞保護效應(yīng)的時效、量效關(guān)系。
　　3、L02細胞以Hyp處理后，RT-PCR、Real-time RT-PCR分別用于分析Hyp對HO-1和Nrf2、Keap1 mRNA水平的影響；雙熒光素酶實驗分析Hyp對HO-1基因表達的誘導(dǎo)作用；WB分析Hyp對Nrf2、Keap1胞漿胞核蛋白含量、MAPK磷酸化和Bach1胞核內(nèi)表達量的影響；IF分析

6、Hyp對Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1、成功建立測定L02細胞內(nèi)外Hyp濃度的HPLC方法，方法專屬性好，回收率、精密度高。隨著孵育時間的延長，進入細胞內(nèi)的Hyp量也逐漸增加。與細胞共培養(yǎng)24 h，細胞內(nèi)的Hyp達峰值11.88％。
　　2、Hyp(10-800μM)能明顯減弱H2O2導(dǎo)致L02細胞活力下降、LDH泄漏百分比增加、MMP和ROS清除能力降低，且效應(yīng)具有劑量依賴性。L02細胞經(jīng)Hyp(10

7、-800μM)預(yù)處理24h后，SOD、HO-1活性呈劑量依賴性地增加。時效研究結(jié)果顯示，Hyp預(yù)處理1 h，細胞ROS清除能力短暫性減弱，HO-1活性顯著增強，細胞活力變化不明顯；Hyp預(yù)處理3 h，三者較正常正常對照組無顯著差異，而后均逐漸增強。
　　3、與正常對照組相比，Hyp能明顯誘導(dǎo)HO-1 mRNA水平上升和蛋白表達量增加，且作用呈劑量依賴性和時間依賴性。Hyp處理后，L02細胞Nrf2 mRNA水平和蛋白表達量均顯著上

8、調(diào)，Nrf2核轉(zhuǎn)位增加。Hyp對Keap1 mRNA的水平無明顯調(diào)節(jié)作用。Hyp(200μM)處理細胞6 h和12 h，胞漿Keap1的表達量明顯減少，而24 h后又恢復(fù)至正常水平。在相同的實驗條件下，未見Keap1在胞核中表達。
　　4、隨著Hyp(200μM)與L02細胞孵育時間的延長，ERK、P38的磷酸化水平逐漸增加，而JNK的磷酸化水平變化不明顯。ERK特異性抑制劑(PD98059)和P38特異性抑制劑(SB203580

9、)均能顯著抑制Hyp導(dǎo)致的Nrf2核轉(zhuǎn)位，而JNK抑制劑(SP600125)對其無明顯影響。
　　5、Hyp(200μM)處理細胞3 h能明顯減少胞核內(nèi)Bach1的表達量，而出核抑制劑LMB能明顯抑制Hyp的這種下調(diào)作用。
　　結(jié)論：
　　1、Hyp可進入L02細胞，且隨著孵育時間的延長，細胞內(nèi)Hyp的濃度逐漸增加，于給藥后24 h達最大值。
　　2、Hyp對H2O2損傷的L02細胞具有保護效應(yīng)。
　　3、