左卡尼汀對過氧化氫損傷人HL7702肝細胞的保護作用研究.pdf

1、目的：左卡尼?。↙-carnitine，LC）又稱左旋肉堿，是人體必需的一種類維生素營養(yǎng)素，在動物性食品中含量豐富。臨床研究發(fā)現(xiàn)，肝病病人體內(nèi)LC缺乏，外源性補充LC對多種肝病具有輔助治療作用。實驗研究也證實，LC對多種因素誘導(dǎo)的肝損傷具有保護作用。目前，LC保肝作用分子機制尚未闡明，本課題將建立過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導(dǎo)的人HL7702肝細胞損傷模型，從抗氧化、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子（Nrf2、MAPK、P

2、I3K/Akt、PPAR-α、AMPK、GSK-3β）的角度探究LC保護肝細胞損傷的分子機制。
　　方法：⑴LC對H2O2損傷HL7702肝細胞活性及抗氧化能力的影響：實驗設(shè)計為：正常對照組、H2O2損傷組、LC組（0.1、0.5、1.0 mmol/L）。分別以MTT、乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）法檢測細胞活性；酶化學法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧

3、化氫酶（catalase，CAT）活性及丙二醛（MDA）含量；以2,7-二氯氫化熒光素二酯（DCFH-DA）為熒光探針，流式細胞術(shù)測定細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。⑵LC對核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid2-related factor2，Nrf2）/血紅素加氧酶1（heme oxygenase，HO-1）通路的調(diào)控：Western blot技術(shù)檢測Nr

4、f2、HO-1蛋白的經(jīng)時表達；免疫熒光染色法確定Nrf2的核轉(zhuǎn)位；凝膠遷移實驗（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）評價Nrf2-DNA結(jié)合活性；Nrf2 siRNA技術(shù)分析Nrf2與HO-1的級聯(lián)關(guān)系及Nrf2在LC保護肝細胞損傷中的作用。⑶LC對絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosph

5、atidylinositol3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路的調(diào)控：Western blot測定H2O2損傷HL7702細胞MAPK、PI3K/Akt通路的變化及LC的影響；應(yīng)用相應(yīng)抑制劑，分析 JNK、ERK、p38MAPK在 H2O2損傷 HL7702細胞中的作用；采用 Akt抑制劑 IV評價 Akt是否參與了LC的保護作用以及LC對Nrf2/HO-1通路的激活作用。⑷LC對H2O2損傷HL

6、7702細胞脂肪酸代謝、能量代謝相關(guān)基因表達的影響：Western blot技術(shù)檢測過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptors-α，PPAR-α）的經(jīng)時表達，并從 mRNA和蛋白水平測定 LC對 PPAR-α及其下游基因肉毒堿棕櫚酸轉(zhuǎn)移酶1（CPT1）、脂肪酰基輔酶A氧化酶（ACOX）的影響；分析PPAR-α在LC保護細胞損傷中的作用及與SOD、CAT的相關(guān)性；測

7、定H2O2損傷HL7702細胞腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK)、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的經(jīng)時變化特點及 LC的調(diào)節(jié)作用；應(yīng)用相應(yīng)抑制劑分析 AMPK在 LC保護細胞損傷中的作用以及PI3K/Akt、AMPK與GSK-3β的級聯(lián)關(guān)系。
　　結(jié)果：①以0.3mmol/LH2O2損傷HL7702細胞12 h為病理

8、模型。0.1?1.0 mmol/L LC劑量依賴性抑制了 H2O2引起的細胞活性降低及 LDH釋放（P<0.05，P<0.01）。與正常對照組相比，H2O2損傷組細胞SOD和CAT蛋白表達水平顯著下降（P<0.01），SOD和CAT活性分別下降了30.07％和38.26％，ROS及MDA水平顯著增加，分別為對照組的3.8倍和1.7倍；LC能夠抑制H2O2引起的SOD、CAT蛋白表達及活性的降低，以及ROS、MDA水平的增加（P<0.05

9、，P<0.01）。②經(jīng)時表達分析發(fā)現(xiàn)，H2O2損傷1 h細胞核Nrf2表達迅速升高，隨后逐漸降低，HO-1表達呈逐漸上升趨勢；LC預(yù)孵育對H2O2誘導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位、Nrf2-DNA結(jié)合活性升高及HO-1蛋白表達增加均有明顯促進作用（P<0.05）；Nrf2 siRNA技術(shù)將細胞Nrf2沉默后，抑制了LC的保護作用及增強HO-1表達的作用。③H2O2損傷后p-JNK、p-ERK、p-p38MAPK表達均迅速升高，p-Akt表達呈先升高

10、后降低的雙相改變；LC能有效抑制H2O2引起的p-JNK、p-p38MAPK表達升高（P<0.05，P<0.01），但對p-ERK表達無明顯影響；LC既能增強損傷1 h時p-Akt的升高（P<0.01），又能抑制損傷12 h時p-Akt的降低（P<0.01）。除ERK抑制劑外，JNK、p38MAPK、Akt抑制劑均能有效抑制H2O2引起細胞活性降低（P<0.05），且Akt抑制劑也抑制了LC對Nrf2/HO-1通路的激活作用。④H2O2

11、損傷肝細胞時PPAR-α蛋白表達逐漸降低；LC預(yù)孵育能增強PPAR-α及其下游基因CPT1、ACOX的表達（P<0.05，P<0.01）；PPAR-α激動劑能有效抑制H2O2引起的SOD、CAT活性及細胞活性的降低；PPAR-α抑制劑阻斷了LC增強SOD、CAT表達及細胞活性的作用。p-AMPK、p-GSK-3β表達在H2O2損傷后逐漸降低，LC對其均有明顯抑制作用（P<0.01），且能抑制AMPK上游激酶肝激酶B1（Liver kin

12、ase B1，LKB1）及下游底物乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）的活性降低（P<0.05，P<0.01）。AMPK抑制劑阻斷了LC增強細胞活性及p-GSK-3β表達的作用，Akt抑制劑對LC增強p-GSK-3β表達的作用無影響。
　　結(jié)論：⑴LC保護H2O2損傷HL7702細胞的作用與升高SOD、CAT活性，降低ROS及MDA水平有關(guān)。⑵LC通過激活A(yù)kt/Nrf2/HO-1通路保護H2O

13、2誘導(dǎo)的HL7702細胞損傷。⑶JNK、p38MAPK的激活參與H2O2損傷HL7702細胞，LC的保護作用與抑制JNK、p38MAPK的激活有關(guān)；ERK未參與H2O2的損傷作用，且與LC的保護作用無關(guān)。⑷PPAR-α參與了H2O2誘導(dǎo)的HL7702細胞損傷。LC通過增加PPAR-α及其下游基因CPT1、ACOX表達，激活LKB1/AMPK/ACC通路，抑制GSK-3β活性而保護H2O2誘導(dǎo)的HL7702細胞損傷，且PPAR-α表達增加