當歸紅芪超濾膜提取物對過氧化氫誘導心肌細胞氧化損傷的保護作用.pdf

1、研究背景：
　　 心血管疾病在我國的發(fā)病率逐年增加，目前已經成為造成我國人民死亡的首要疾病。近年來的大量研究表明，心肌細胞凋亡是多種心血管疾病如心力衰竭、擴張性心肌病(DCM)、阿霉素誘導性心肌病和病毒性心肌炎、心肌梗塞、心肌缺血等的一個重要的發(fā)生和進展機制。同時細胞凋亡參與心室重構和心功能不全的發(fā)生，是心功能遠期預后的重要預報因子。
　　 缺氧、缺氧復氧、酸中毒、氧化應激、壓力應激等多種刺激均可誘導心肌細胞產生凋亡。其

2、中，氧自由基代謝障礙是心肌細胞凋亡的重要促發(fā)因素，生物體內存在的活性氧可以與DNA、蛋白質、多元不飽和脂肪酸等作用，造成DNA鏈斷裂、突變和對熱穩(wěn)定性的改變，嚴重影響遺傳信息的傳遞，使細胞代謝功能紊亂；導致蛋白質與蛋白質交聯(lián)、蛋白質與DNA交聯(lián)，使其理化性質和生物學功能發(fā)生改變；作用于生物膜的多不飽和脂肪酸，使其發(fā)生脂質過氧化[6]，造成膜的完整性被破壞、膜流動性下降、膜脆性增加，影響細胞內外物質與信息的交換。當活性氧過氧化氫(H2O2

3、)高濃度作用于心肌細胞時，可致細胞內活性氧水平迅速增加，并誘導體內抗氧化劑如：超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱苷肽過氧化物酶等的活性降低，使生物膜的結構和功能的完整性遭到破壞，致使細胞發(fā)生凋亡。
　　 細胞凋亡又稱程序性死亡(PCD)，是多細胞有機體為保持自身組織穩(wěn)定、調控自身細胞的增殖和死亡之間的平衡、由基因控制的細胞主動性死亡過程。誘導細胞凋亡的因素很多，體內代謝或外源性因素產生的自由基均被證實可誘導細胞凋亡.在細胞凋亡的發(fā)

4、生機制研究中，已知的引起細胞凋亡的信號傳導通路有：死亡因子介導的細胞凋亡；神經酰胺介導的細胞凋亡；p53+基因觸發(fā)的細胞凋亡；線粒體損傷啟動的細胞凋亡。通過以上通路，細胞凋亡的結果使體細胞特別是具自重要功能的細胞如腦細胞、心肌細胞數(shù)量減少，造成其組成的重要器官如心室肌等發(fā)生衰退性病理過程。在心肌細胞凋亡中研究較多的有兩條主要的信號轉導通路，即線粒體通路和膜死亡受體通路。
　　 通過干預心肌細胞凋亡能在一定程度上保護心肌細胞，因此

5、，人們在研究藥物對心肌細胞凋亡影響方面產生了濃厚的興趣。長期以來，中藥在心血管疾病的治療中占據(jù)了一定的地位。目前，中藥與心肌細胞凋亡相關性的研究正受到普遍關注，并取得了一些可喜的成果，其研究正在不斷深入，尤其在探索中藥有效單體成分對心肌細胞凋亡的影響方面。
　　 本實驗室運用超濾膜技術對傳統(tǒng)方劑當歸補血湯進行分離純化，前期研究已證實，當歸紅芪超濾膜提取物具有清除氧自由基，抗脂質過氧化，抗心肌細胞凋亡的作用。在本課題中，通過模擬體

6、內心肌細胞氧化損傷過程，建立H2O2誘導體外培養(yǎng)心肌細胞凋亡模型，觀察當歸紅芪超濾膜提取物對氧化損傷誘導的體外培養(yǎng)心肌細胞凋亡的影響，從而為明確當歸紅芪超濾膜提取物抗凋亡的作用機制及其臨床應用價值奠定基礎。
　　 目的：
　　 1、運用超濾膜技術對中藥合劑進行分離、純化。
　　 2、研究當歸紅芪超濾膜提取物抗心肌細胞氧化損傷的作用。
　　 3、研究當歸紅芪超濾膜提取物抗心肌細胞凋亡的作用。
　　

7、4、研究當歸紅芪超濾膜提取物對氧應激狀態(tài)下心肌細胞熱休克蛋白70表達的影響。
　　 5、為當歸紅芪超濾膜提取物的臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、應用陶瓷膜微濾和聚丙烯腈(PAN)中空纖維超濾膜(截留分子量為10萬分子量)精制當歸、紅芪合劑(1∶5)水提物。
　　 2、Wistar乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)：取出生后1～3d的大鼠乳鼠，用75％乙醇溶液浸泡消毒皮膚后，移入超凈工作臺。開胸取出心室肌

8、，運用酶消化法反復多次消化，收集細胞懸液，以差速貼壁法分離純化心肌細胞，用含15％小牛血清的DF培養(yǎng)液調整細胞濃度至每毫升5×105，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。選生長狀態(tài)佳者于72 h后進行實驗。采用臺盼藍染色法檢測心肌細胞存活率。采用心肌細胞α橫紋肌肌動蛋白(α-Sarcomericactin)的免疫細胞化學染色方法鑒定心肌細胞純度。
　　 3、制備乳鼠心肌細胞氧化應激性損傷模型：以400μmol·L-1的H2O2誘導心

9、肌細胞凋亡。實驗分為以下5組：正常對照組；H2O2模型組(作用6h)；當歸紅芪超濾膜提取物高劑量干預組(15 g·L-1)、當歸紅芪超濾膜提取物中劑量(7.5 g·L-1)干預組、當歸紅芪超濾膜提取物低劑量(3.75 g·L-1)干預組。倒置相差顯微鏡觀察心肌細胞形態(tài)學改變：MTT法檢測心肌細胞細胞活力改變；Annexin V-FITC/PI雙染法標記凋亡心肌細胞，采用流式細胞術檢測各組心肌細胞凋亡指數(shù)。
　　 4、應用半定量逆

10、轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術和蛋白印(Western-blotting)技術測定凋亡相關基因蛋白Hsp70、Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達。
　　 5、用生化學技術檢測氧化應激狀態(tài)下心肌細胞相關酶類如SOD、LDH、CK、MDA、MPO的變化。
　　 結果：
　　 1、經紫外分光光度計測定，10萬分子量當歸紅芪超濾膜提取物多糖含量接近單劑含量，當歸多糖含量為23.84 g·L-1，紅芪多糖含

11、量為27.55 g·L-1，合劑多糖含量為22.08g·L-1。
　　 2、倒置相差光學顯微鏡下觀察：正常心肌細胞伸出偽足互相融合成片，細胞核折光性好，搏動具有整體性、協(xié)調性和規(guī)律性。H2O2損傷組細胞皺縮，細胞核暗淡，搏動明顯減弱，部分停搏，搏動幅度強弱不一，搏動頻率與正常對照組相比較差異具有顯著性。當歸紅芪超濾物高、中、低劑量干預組心肌細胞搏動頻率分別為86.9±8.4、71.1±6.7和43.7±9.6次/min，細胞偽足

12、較對照組變細，搏動頻率略減低，但高于氧化損傷組。
　　 3、MTT法檢測心肌細胞的存活率：氧化損傷模型組心肌細胞嚴重受損，細胞存活率顯著降低，與正常對照組比較具有統(tǒng)計學意義。當歸紅芪超濾物干預組心肌細胞的受損顯著改善，存活率顯著提高，高、中、低劑量組分別為77.6％、64.40％、43.9％，與氧化損傷組比較差異顯著。
　　 4、生化學檢測：H2O2處理使細胞膜的通透性增加，培養(yǎng)介質中LDH、CK的含量增加，與正常對照組

13、比較。當歸紅芪超濾物可顯著抑制H2O2所致心肌細胞膜通透性的改變，高劑量組、中劑量組、低劑量組均能減少LDH、CK的外漏，與模型組比較差異顯著。H2O2損傷組細胞內MDA、MPO含量增加、SOD活力降低，與正常對照組(MDA2.34±0.50 nmol/mL，MPO38.47±1.12 U/L，SOD118.33±5.77U/mL)比較，差異顯著。當歸紅芪超濾物可顯著降低心肌細胞內MDA、MPO的含量，提高SOD活力，高劑量組、中劑量組

14、、低劑量組與模型組比較均具有顯著性差異；且呈劑量依賴關系，隨超濾物濃度的增加LDH、CK、MDA、MPO含量逐漸減少，SOD活力逐漸增加。
　　 5、RT-PCR檢測結果：正常對照組Hsp70、Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA呈低水平表達，模型組Hsp70、Caspase-3、Bax mRNA表達量顯著增加，Bcl-2 mRNA表達量顯著降低，與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義；與模型組比較，各超濾物干預組Hsp7

15、0 mRNA呈過度表達，Bcl-2 mRNA表達量顯著增加，而Bax、Caspase-3 mRNA表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 6、Western-blotting檢測結果：400μmol·L-1 H2O2處理心肌細胞6h后，模型組心肌細胞中Hsp70、Bax蛋白的表達明顯增加，Bcl-2蛋白的表達明顯降低，與正常對照組比較差異具有顯著性，Bcl-2/Bax的蛋白比值降低。而經當歸紅芪超濾膜提取物處理后，心肌細胞中H

16、sp70蛋白表達量均較模型組顯著增加；在高劑量組和中劑量組細胞中Bcl-2蛋白表達顯著增加，Bax蛋白表達顯著降低，Bcl-2/Bax比值顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義。低劑量組則Bcl-2、Bax蛋白表達無顯著改變。
　　 結論：
　　 1、氧化損傷是誘導心肌細胞凋亡的重要原因之一。
　　 2、當歸紅芪超濾膜提取物具有抗過氧化氫誘導心肌細胞損傷的作用，可減輕細胞活力的下降，抑制心肌細胞凋亡。
　　 3、B