金絲桃苷保護肝細胞L02氧化應激損傷的分子機制探討.pdf

1、研究背景和目的:
　　氧化應激損傷是指機體在受到藥物、化學物質、重金屬物質和電離福射等刺激時,體內自由基的產(chǎn)生和抗氧化防御系統(tǒng)之間的平衡被破壞,使ROS(reactive oxygen species,活性氧自由基)和RNS(reactive nitrogen species,活性氮自由基自由基)等各種高氧化性活性物質產(chǎn)生量過多或者是機體清除能力不足,從而造成機體細胞和組織不同程度損傷的病理和生理學過程。ROS或RNS可以通過直接

2、或間接等方式引起細胞內生物大分子如蛋白質、脂質和核酸等的化學修飾,從而影響這些大分子的結構和功能,進而影響機體細胞、組織和器官乃至整體的結構、代謝和功能。
　　紅系衍生核因子相關因子-2(nuclear factor-E2-related factor2,Nrf2)是一種對細胞內氧化還原狀態(tài)(Redox)的變化非常敏感的轉錄因子,可誘導多種抗氧化蛋白的基因表達。在靜息狀態(tài)下,它能夠在胞漿中與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白-1(Ke

3、lch-like ECH associating protein1,Keap1)蛋白結合,從而形成Nrf2/Keap1偶聯(lián)復合體,其活性處于相對抑制狀態(tài),并可進一步由26S蛋白酶體識別和降解,使Nrf2在細胞內保持較低的水平。當發(fā)生氧化應激時,細胞內呈氧化狀態(tài),Keap1分子內的巰基被氧化為二硫鍵,Nrf2從復合體中解離出來,轉移入核并能與小Maf蛋白(包括 MafG、MafK和 MafF)形成異二聚復合體,識別并結合到抗氧化反應元件(

4、antioxidant response element, ARE)上,對II相相關解毒酶及抗氧化酶基因表達進行調控,通過增強細胞內的抗氧化活性,從而減小氧化應激對細胞或組織造成的損傷,維持機體內氧化和抗氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡。
　　BTB-CNC異體同源體1(BTB and CNC homology1,Bach1)同Nrf2一樣屬于CNC轉錄因子家族成員之一,是一種亞鐵血紅素結合蛋白。Bach1與 Nrf2的功能不同,在氧化應激中,

5、Bach1可與小 Maf類蛋白結合生成異源二聚體,從而與Maf識別元件(MARE)相結合,可以抑制抗氧化蛋白的基因轉錄。近年來研究發(fā)現(xiàn),Nrf2和Bach1可以調控抗氧化基因血紅素加氧酶(Heme oxygenase1,HO-1)的表達,并且二者的作用是相互拮抗的。Nrf2/Keap1-ARE抗氧化系統(tǒng)信號通路是目前被認為細胞抵抗氧化應激損傷的最重要機制。
　　課題組前期研究發(fā)現(xiàn),天然黃酮類物質金絲桃苷(Hyp)具有明顯的肝保護效

6、應,且與上調細胞保護蛋白水平和增強細胞保護蛋白酶活性相關。本研究擬在進一步明確Hyp的肝細胞保護效應基礎上,針對 Nrf2與Bach1相互競爭結合HO-1等基因啟動子區(qū)域的 ARE,探討Hyp上調抗氧化蛋白基因表達,發(fā)揮抗氧化應激損傷效應的機制。研究結果有助于深入闡述Hyp的抗氧化應激損傷機制,為抗氧化性肝損傷藥物的開發(fā)與改造提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.用H2O2處理肝細胞(L02),建立氧化應激損傷模型。
　

7、　2.通過MTT法檢測其細胞活力,檢測MDA、ROS等反映細胞內氧化還原狀態(tài)與氧化應激損傷,檢測Hyp對抗氧化應激損傷、保護肝細胞的時效、量效關系。
　　3.RT-PCR和Real-time RT-PCR檢測Hyp對H2O2處理的L02細胞中HO-1的mRNA水平的影響。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)(轉染hHO4.9luc質粒)研究Hyp對HO-1基因啟動子轉錄活性的影響;
　　4.Western Blot檢測 L02細胞 Nrf

8、2、Bach1和 Keap1蛋白表達水平,研究 Hyp的作用效果;
　　5.運用免疫熒光細胞化學染色分析關鍵調控因子Nrf2和Bach1在細胞質和細胞核表達分布(即核轉位)特點;
　　6.通過構建并轉染 pEGFP-C1-Bach1表達載體,上調 L02細胞 Bach1水平,研究其對Nrf2和HO-1表達的影響
　　7.染色質免疫共沉淀技術分析 Hyp對HO-1啟動子 ARE區(qū)域Bach1及Nrf2結合特點的影響。

9、r>　　結果:
　　1.H2O2能導致L02細胞活力下降,且效應具有濃度依賴性,當 H2O2濃度達到2.5 M時,作用1h能完全抑制L02細胞的生長,H2O2處理1h抑制L02細胞生長的IC50為0.126 M。L02細胞預先經(jīng) Hyp(12.5-800μM)處理24h后,采用0.1M的H2O2處理1h,與正常對照組相比 Hyp濃度為200、400和800μM時,明顯增強細胞活力。同時,Hyp顯著削弱H2O2引起細胞內ROS與MD

10、A水平增高。
　　2.L02細胞用200μM的Hyp預處理24 h,H2O2誘導1h后。與H2O2模型組相比,Hyp能明顯誘導Nrf2的mRNA水平與蛋白水平上升,且作用呈濃度依賴性和時間依賴性,對Keap1和 Bach1的影響不明顯。Hyp同時增加 Nrf2和Bach1在細胞核積聚量,但對Nrf2的作用更加明顯。
　　3.雙熒光素酶報告基因結果顯示,與對照組相比,Hyp顯著提升HO-1基因啟動子的轉錄活性,為對照組的2.7

11、倍。
　　4.轉染pGFP-C1-Bach1表達載體,上調Bach1表達后,顯著降低Nrf2和HO-1水平。
　　5.CHIP實驗結果證實,在Bach1和Nrf2相互競爭性結合ARE過程中,Hyp提升Nrf2與ARE的結合水平,但對Bach1作用不明顯。
　　結論
　　1.Hyp對H2O2誘導的L02肝細胞氧化性損傷具有保護效應。
　　2.Hyp促進HO-1基因啟動子轉錄活性及基因表達。
　　3. H