石參有效成分對(duì)胰島細(xì)胞及肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用.pdf

1、研究背景和目的:
　　 據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示，我國(guó)糖尿病(DM)已躍居繼美國(guó)后的世界第二位患病大國(guó)，成年人群中糖尿病患病率達(dá)到3.5％左右，總?cè)藬?shù)超過(guò)4000萬(wàn)人;并且以每年0.1％的速度增長(zhǎng)，而其中90％為Ⅱ型糖尿病(T2DM)。面對(duì)我國(guó)Ⅱ型糖尿病流行的嚴(yán)峻現(xiàn)狀，中國(guó)糖尿病防治指南多次明確提出，目前我國(guó)Ⅱ型糖尿病防治面臨的主要挑戰(zhàn)和任務(wù)之一，就是降低Ⅱ型糖尿病的發(fā)病率，對(duì)Ⅱ型糖尿病進(jìn)行早期干預(yù)。
　　 Ⅱ型糖尿病早期

2、共同的特點(diǎn)是糖耐量減低(impaired glucose tolerance，IGT)和/或空腹血糖受損(Impaired fasting glucose，IFG)。IGT/IFG是介于正常血糖與糖尿病之間的一種糖代謝異常，是Ⅱ型糖尿病自然病程中一個(gè)階段。正?？崭寡菫?.9-5.6 mmol/L，糖尿病時(shí)空腹血糖≥7 mmol/L。IGT表現(xiàn)為口服葡萄糖糖耐量試驗(yàn)(OGTT)時(shí)，其空腹血漿葡萄糖＜7.0 mmol/L，口服葡萄糖后2h

3、血糖7.8-11.1mmol/L，而空腹血糖在5.6-7.0 mmol/L之間時(shí)診斷為IFG。胰島素抵抗（IR）和胰島素分泌缺陷是IGT/IFG的主要原因。其中，IGT主要與胰島素分泌缺陷有關(guān)，而IFG主要與IR有關(guān)。許多研究證明，IR和胰島素分泌缺陷與血脂(尤其是游離脂肪酸，F(xiàn)FA)升高有關(guān)。
　　 目前IGT/IFG防治主要提倡飲食和生活方式干預(yù)。近年來(lái)，也有報(bào)道用小劑量二甲雙胍、匹格列酮或阿卡波糖等進(jìn)行IGT/IFG干預(yù)治

4、療，能明顯預(yù)防糖尿病和心血管并發(fā)癥。但由于不良反應(yīng)多，再加上相當(dāng)一部分IGT/IFG患者不會(huì)發(fā)展為Ⅱ型糖尿病，因此，口服降糖藥早期干預(yù)還需要進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。
　　 而中醫(yī)認(rèn)為IGT/IFG類(lèi)似于脾癉，脾癉的后果是轉(zhuǎn)為消渴。中醫(yī)對(duì)IGT/IFG治療最主要的方法還是以辨證辨病結(jié)合治療為主，辨證分型尚處于初期探索性階段，缺乏規(guī)范的臨床試驗(yàn)。IGT/IFG是發(fā)揚(yáng)中醫(yī)藥治療優(yōu)勢(shì)的潛在病種，它是糖尿病發(fā)病前期的“亞健康狀態(tài)”，符合中醫(yī)治未病的

5、思想，適合長(zhǎng)期治療。故挖掘和應(yīng)用中藥、天然藥物治療IGT/IFG前景廣闊，具有很好的實(shí)用價(jià)值。
　　 石參(Uraria crinita)是豆科貍尾豆屬的多年生直立亞灌木植物，主要分布于我國(guó)南方沿海省份，包括廣東、廣西、海南、福建、臺(tái)灣。《廣西中藥志》中記載:其味甘，性溫，無(wú)毒;歸肺、胃二經(jīng);行氣痛，逐瘀化痰，治心胃氣痛，有清熱解毒、滲濕的功效。民間用于治療胃炎、浮腫、風(fēng)寒感冒等，我國(guó)南方常用作湯劑或燉劑，常食有保健作用，是效果

6、良好的藥材和藥膳材料，享有“北有人參，南有石參”的美譽(yù)。
　　 為了進(jìn)一步探討石參的有效部位，我們對(duì)石參進(jìn)行乙酸乙酯、乙醇和水梯度提取，觀察了提取物對(duì)高脂飼料+小劑量鏈脲霉素誘導(dǎo)的C57BL/6J糖尿病小鼠的作用，結(jié)果表明，18g藥材/kg的石參乙酸乙酯、乙醇和水梯度提取物，對(duì)模型小鼠非空腹血糖降糖效果依然不明顯，但顯著降低空腹血糖，分別降低25％、33％和27.3％，而對(duì)照組消渴丸1500mg/kg降低空腹血糖的水平為12％。

7、3種提取物對(duì)血漿胰島素水平無(wú)明顯影響，但有不同程度降低游離脂肪酸(FFA)和甘油三酯(TG)的作用，尤其是乙醇提取物降低游離脂肪酸(FFA)的作用達(dá)54％，對(duì)照組消渴丸為33％。表明石參提取物中，有多種成分參與了改善IGT/IFG作用，該作用與降低血脂，尤其是降低游離脂肪酸(FFA)的有關(guān)。其中，最明顯的為乙醇提取物。
　　 2009年，華中科技大學(xué)同濟(jì)藥學(xué)院和湖北省天然藥物化學(xué)與資源評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)石參化學(xué)成分進(jìn)行了分離鑒定，

8、從10kg石參根粗粉乙醇提取物中分離并鑒定了14個(gè)化合物，總含量為143mg。其中，已報(bào)道有明顯降糖作用、可用于糖尿病治療的化合物包括染料木素(14mg)、水飛薊賓(8mg)和白樺脂醇(11mg)，這3種化合物含量占總提取物含量的23.1％。我們認(rèn)為，石參乙醇提取物效果更好的原因可能與這些成分有關(guān)。
　　 已知的石參提取物中，黃酮類(lèi)化合物幾乎占40％。眾所周知，黃酮類(lèi)有較強(qiáng)的抗氧化作用，為了評(píng)價(jià)石參中黃酮類(lèi)的抗氧化活性，我們提取

9、了石參總黃酮，研究其體外抗氧化活性及對(duì)大鼠胰島瘤細(xì)胞(INS-1E)氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，石參總黃酮體外對(duì)DPPH、ABTS、·OH自由基、H2O2、NO等自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化有明顯抑制作用，并具有濃度依賴(lài)性。能顯著提高氧化應(yīng)激下的INS-1E細(xì)胞的存活率，提高谷胱甘肽(GSH)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)的含量。說(shuō)明石參總黃酮具有清除自由基活性，對(duì)胰島β-細(xì)胞氧化應(yīng)激有保護(hù)作用。<

10、br>　　 以上分析說(shuō)明，石參提取物中，染料木素、水飛薊賓和白樺脂醇這幾種重要成分對(duì)IGT/IFG的改善作用可能通過(guò)4種途徑，即降血脂、增加葡萄糖利用、抗氧化和促進(jìn)胰島素釋放。而且，這幾種成分通過(guò)多靶點(diǎn)作用，可能起到了協(xié)同效應(yīng)。因?yàn)閱我怀煞钟行┝慷荚诿抗矬w重（鼠）幾十到幾百毫克級(jí)，而我們給石參的量，按5-20mg/10kg藥材的提取率算，大約是每公斤體重（鼠）幾十微克，即使實(shí)際含量增加10倍，石參提取物中各成分的含量與文獻(xiàn)報(bào)道的單

11、一有效量也相差10-100倍以上，但改善IGT/IFG和降低脂肪酸效果相似，說(shuō)明石參提取物中多種成分之間起了協(xié)同作用。
　　 基于以上假設(shè)，本課題將在前期工作基礎(chǔ)上，用不同的細(xì)胞，研究石參總黃酮及有效成分染料木素，水飛薊賓和白樺脂醇聯(lián)合用藥逆轉(zhuǎn)體外細(xì)胞糖尿病模型的效果，為石參及其有效部位和有效成分用于Ⅱ型糖尿病早期預(yù)防提供安全、有效的措施和依據(jù)，對(duì)發(fā)掘應(yīng)用中藥預(yù)防Ⅱ型糖尿病，降低本病發(fā)病率有重要的意義。
　　 方法:

12、r>　　 1.RIN-m細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及石參總黃酮的保護(hù)作用
　　 指數(shù)生長(zhǎng)期的RIN-m細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1*104個(gè)細(xì)胞，用0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/ml等濃度的石參總黃酮處理細(xì)胞后，再用濃度為10mM的SNP構(gòu)建損傷模型，然后用MTT法在570nm處檢測(cè)細(xì)胞活力。
　　 2.石參總黃酮對(duì)RIN-m細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下SOD活性，MDA，GSH和細(xì)胞內(nèi)外液NO含量的影響
　　

13、 指數(shù)生長(zhǎng)期的RIN-m細(xì)胞接種于24孔板中，每孔1*105個(gè)細(xì)胞，用0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/ml等濃度的石參總黃酮處理細(xì)胞后，再用濃度為10mM的SNP構(gòu)建損傷模型，然后收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞破碎液，用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)MDA，GSH，NO含量和SOD活性。
　　 3.HEPG2細(xì)胞胰島素抵抗及染料木素、水飛薊賓和白樺脂醇聯(lián)用對(duì)模型的逆轉(zhuǎn)效果
　　 指數(shù)生長(zhǎng)期的HEPG2細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1

14、*104個(gè)細(xì)胞，用總濃度為1、0.5、0.25 nM的染料木素，水飛薊賓和白樺脂醇的復(fù)方藥物和0.25 mM的軟脂酸一起處理細(xì)胞12h，然后用含有1*10-7M胰島素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8h，然后用葡萄糖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)上清中葡萄糖含量，再在570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)胞活力。
　　 4.INS-1E細(xì)胞脂肪酸損傷模型構(gòu)建及染料木素、水飛薊賓和白樺脂醇聯(lián)用對(duì)模型的逆轉(zhuǎn)效果
　　 指數(shù)生長(zhǎng)期的INS-1E細(xì)胞接種于96孔板中，每孔

15、1*104個(gè)細(xì)胞，用總濃度為2、1nM的染料木素，水飛薊賓和白樺脂醇的復(fù)方藥物和0.5mM的軟脂酸一起處理細(xì)胞24 h，然后用MTT法在570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)胞活力。
　　 結(jié)果:
　　 1.石參總黃酮對(duì)RIN-m細(xì)胞氧化應(yīng)激保護(hù)實(shí)驗(yàn)研究顯示，10mM的SNP作用4小時(shí)后能顯著的損傷細(xì)胞(P＜0.05)，而不同濃度的石參總黃酮皆能顯著的提高模型的細(xì)胞活力(P＜0.05)。
　　 2.石參總黃酮能在一定濃度下對(duì)RI

16、N-m細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下MDA，GSH的含量和SOD活性產(chǎn)生改善作用，但只有在高劑量下才能對(duì)細(xì)胞內(nèi)外液NO含量產(chǎn)生顯著影響。石參總黃酮對(duì)RIN-m細(xì)胞的氧化應(yīng)激具有一定的保護(hù)作用，其主要原因可能是由于其對(duì)GSH含量的影響和對(duì)SOD活力的改善。
　　 3.染料木素，水飛薊賓和白樺脂醇的聯(lián)合給藥能在比單體給藥較低的濃度就能顯著的改善軟脂酸誘導(dǎo)的HEPG2細(xì)胞胰島素抵抗(P＜0.05)，提高在胰島素存在下細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用，且這種提高

17、并不通過(guò)提高細(xì)胞活力而達(dá)到，因此推斷是藥物改善了細(xì)胞胰島素的敏感性而致。
　　 4.染料木素，水飛薊賓和白樺脂醇的聯(lián)合給藥能顯著的改善軟脂酸誘導(dǎo)的INS-1E損傷，但復(fù)方給藥和單體給藥之間并無(wú)顯著性差異。
　　 結(jié)論:
　　 石參總黃酮對(duì)胰島細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有明顯的保護(hù)效果，能有效的改善氧化應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞MDA，GSH含量和SOD活性。而石參總黃酮中主要的染料木素，水飛薊賓和白樺脂醇聯(lián)用能在不影響細(xì)胞活力的