NAD對(duì)抗X射線誘導(dǎo)L02細(xì)胞損傷的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　 放射治療是惡性腫瘤治療的重要手段之一,但放射治療在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí),不可避免地?fù)p傷正常組織,也因此限制了腫瘤放射治療的照射劑量強(qiáng)度,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不能被完全殺滅而使病人生存質(zhì)量的下降。
　　 國內(nèi)外學(xué)者研究提示,輻射致細(xì)胞損傷的機(jī)理主要集中在如下幾個(gè)方面:1)改變細(xì)胞信號(hào)傳遞途徑:細(xì)胞經(jīng)受輻射后,細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外多種信號(hào)分子受其誘導(dǎo),引起信號(hào)傳遞途徑的改變,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。其中,p53具有中心地位作用[

2、3]。2)DNA損傷:輻射引起DNA損傷,包括單鏈斷裂(SSB)、雙鏈斷裂(DSB)、堿基損傷和蛋白質(zhì)交聯(lián)等多種形式[4]。3)細(xì)胞周期調(diào)控:主要通過調(diào)控細(xì)胞周期GO/G1、S、G2/M調(diào)控點(diǎn),調(diào)節(jié)細(xì)胞輻射敏感性和輻射抗性[5]。細(xì)胞DNA損傷后,野生型p53基因誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入G1期,直到損傷DNA修復(fù),若損傷不被修復(fù),p53基因就活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因轉(zhuǎn)錄,使細(xì)胞發(fā)生凋亡[6]。4)微環(huán)境變化:細(xì)胞的生存離不開其微環(huán)境,包括細(xì)胞氧供應(yīng)、

3、pH值、營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、離子平衡、細(xì)胞因子等,其微環(huán)境改變可引起相關(guān)基因表達(dá)和細(xì)胞對(duì)輻射的反應(yīng)。
　　 隨著細(xì)胞輻射損傷分子機(jī)制的深入研究,輻射損傷防護(hù)方面的研究也取得了較大進(jìn)展。其中,有關(guān)輻射損傷防護(hù)劑的研究,近年來有較多報(bào)道,主要涉及以下幾類:1)抗氧化劑,如Amifostine[7,8,9]、NAC[10,11,12]、VitC[13,14]等；2)細(xì)胞因子,如IL-2、IL-3、IL-6、TGF等[15]；3)微量元

4、素,如硒、鋅等[16,17]；4)中草藥成分,如人參皂甘、迷迭香等[18,19]。但由于目前研究較多的抗氧化劑Amifostine、NAC毒副作用大,細(xì)胞因子作用網(wǎng)絡(luò)化特點(diǎn)以及中草藥成分難以提純,還沒有一種較為理想的輻射防護(hù)劑應(yīng)用于臨床。尋找一種新的有效的毒副作用小的輻射防護(hù)藥物對(duì)輻射防護(hù)仍具重要意義。
　　 NAD+,化學(xué)名為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸,是細(xì)胞能量代謝重要輔酶,參與細(xì)胞氧化還原反應(yīng)和呼吸鏈電子傳遞,在線粒體內(nèi)NAD+

5、接受電子傳遞還原成NADH,通過電子傳遞能夠抑制自由基生成,同時(shí)生成細(xì)胞代謝所需的ATP,因此可能起到保護(hù)細(xì)胞免遭輻射損傷的作用。
　　 本研究采用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法,初步探討NAD+輻射損傷防護(hù)作用及其機(jī)制,這對(duì)于進(jìn)一步研究正常組織細(xì)胞的放射損傷機(jī)理和探尋一種新的有效的、毒副作用小的輻射防護(hù)藥物具有理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。
　　 目的：
　　 本研究通過觀察氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)對(duì)輻射損傷的人正常肝細(xì)胞株

6、L02細(xì)胞的影響,初步探討氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)抗輻射損傷作用及其機(jī)制。進(jìn)而為研究醫(yī)源性和非醫(yī)源性輻射損傷防護(hù)、尋求新型放射防護(hù)劑提供一種新的思路和手段。
　　 方法
　　 1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 正常人肝細(xì)胞株L02細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將L02細(xì)胞分為3組:處理組和照射組細(xì)胞照射后分別加入含和不含NAD(1000 μg/ml)的RPMI-1640培養(yǎng)基

7、；對(duì)照組細(xì)胞未照射,僅加入RPMI-1640培養(yǎng)基。
　　 2 X射線照射 采用Varian 6-MV X線直線加速器,照射劑量為5 Gy,劑量率為500cGy/min,照射源距靶中心距離100cm。
　　 3 MTT法檢測不同濃度NAD對(duì)細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞以每孔3 × 105～5×105/ml接種于96孔組織培養(yǎng)板,100 ul/孔,細(xì)胞貼壁后去上清,加入0.01mol/LPBS(pH 7.4),按照上述條件進(jìn)行X線

8、照射。照射后去上清,加入RPMI 1640(含10％胎牛血清)稀釋的不同濃度的NAD,分別為0、200、400、600、800、1000、1200、1400 ug/ml,100 ul/孔,在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。用MTT比色法檢測各濃度NAD對(duì)L02細(xì)胞增殖的影響。
　　 4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 L02細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后制備成單細(xì)胞懸液,以每孔3×105～5×105/ml接種于6孔組織培養(yǎng)板,1ml/孔,

9、待細(xì)胞貼壁后去上清,加入0.01mol/LPBS(pH 7.4),按照上述條件進(jìn)行X線照射。照射后去上清,處理組和照射組分別加入含和不含NAD(1000 μg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基,在37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h。收集各組細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106～6×106/ml,采用Annexin V/PI染色,檢測細(xì)胞凋亡率。
　　 5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 細(xì)胞以每孔3×105～5×105/ml接種于6孔組織培養(yǎng)

10、板,1ml/孔,待細(xì)胞貼壁后去上清,加入0.01mol/LPBS(pH 7.4),按照上述條件進(jìn)行X線照射。照射后去上清,處理組和照射組分別加入含和不含NAD(1000μg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基,在37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h。收集各組細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為3×106～6×106/ml,離心后PBS洗滌,加入冰冷的70％乙醇固定,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞百分比。
　　 6 流式細(xì)胞儀檢測p53、bax、

11、bcl-2蛋白表達(dá)百分率 分別收集經(jīng)過上述處理的三組細(xì)胞,以0.5％多聚甲醛溶液1ml固定30min,破膜劑裂解細(xì)胞后分管、洗滌、離心后去上清,各管分別加入鼠抗人p53、bax、bcl-2單克隆抗體,混勻,37℃孵育1h。洗滌離心后分別加入FITC標(biāo)記的抗鼠二抗,37℃孵育1h,在流式細(xì)胞儀上檢測蛋白表達(dá)百分率。
　　 7 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性測定 分別收集5×106個(gè)經(jīng)過上述處理的三組

12、細(xì)胞,按試劑盒說明書進(jìn)行每步操作,另設(shè)未加細(xì)胞而其他操作一樣的孔為空白對(duì)照組,通過酶標(biāo)儀405nm處測定各孔吸光度OD值。
　　 8 透射電鏡觀察L02細(xì)胞形態(tài) 用3％瓊脂糖在錐形離子管中制造中間帶錐形孔的模具,加入收集處理的細(xì)胞,離心,2.5％戊二醛固定、1％鋨酸固定雙重固定,酒精梯度脫水,環(huán)氧丙烷浸透,脂包埋,超薄切片,電子染色電鏡觀察。
　　 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)

13、據(jù)用(x)±s表示,行單因素方差分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1 MTT法檢測不同濃度NAD對(duì)細(xì)胞增殖的影響 L02細(xì)胞在接受5.0Gy X線照射后,加入RPMI 1640(含10％胎牛血清)稀釋的不同濃度的NAD,分別為0、200、400、600、800、1000、1200、1400 ug/ml,在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。MTT檢測細(xì)胞增殖活性,隨著NAD濃度的增加,細(xì)胞增

14、殖活性升高,在NAD濃度為1000～1400 ug/ml時(shí),照射后細(xì)胞增殖活性的增加達(dá)到平臺(tái)期。因此我們把NAD濃度為1000 ug/ml作為以后的實(shí)驗(yàn)條件。
　　 2 各組細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞照射后培養(yǎng)24h檢測各組細(xì)胞凋亡率,對(duì)照組(1.50±0.67)與處理組(12.85±1.59)均顯著低于照射組(31.72±3.07)(P<0.05)。說明NAD能明顯降低X線照射后的L02細(xì)胞的凋亡率,具有抗X線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。

15、>　　 3 NAD對(duì)受照細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)L02細(xì)胞在X線照射后24h時(shí)間點(diǎn)G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞數(shù),照射組與對(duì)照組相比G1、S期細(xì)胞數(shù)明顯增加,G2/M期細(xì)胞數(shù)減少,表現(xiàn)為G1期阻滯；處理組與照射組相比,G1期細(xì)胞數(shù)減少,S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)增加,表現(xiàn)為處于細(xì)胞分裂期和細(xì)胞DNA合成期細(xì)胞數(shù)增加。
　　 4 NAD對(duì)X射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)L02細(xì)胞經(jīng)5.0GyX線照射后培養(yǎng)24h,檢測三組細(xì)胞的凋亡相

16、關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)。處理組細(xì)胞p53、bax表達(dá)低于照射組(P<0.05),而照射組高于對(duì)照組(P<0.05),表明細(xì)胞受照射后p53、bax表達(dá)增強(qiáng),NAD能夠減少細(xì)胞受照射后p53、bax表達(dá)。三組細(xì)胞的bcl-2表達(dá)情況則恰恰相反,處理組細(xì)胞bcl-2表達(dá)高于照射組(P<0.05),而照射組低于對(duì)照組(P<0.05),表明細(xì)胞受照射后bcl-2表達(dá)減少,NAD能夠上調(diào)細(xì)胞受照射后bcl-2的表達(dá)。
　　 5 NAD對(duì)受照射細(xì)胞Ca

17、spase-3、Caspase-8、Caspase-9活性的影響 細(xì)胞經(jīng)照射培養(yǎng)24h后,NAD+處理組L02細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性較照射組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明NAD能抑制Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性,從而抑制X線照射引起的L02細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論
　　 一、NAD+能夠抑制X射線誘導(dǎo)的L02細(xì)胞增殖活性的下降,

18、能夠降低X射線引起的L02細(xì)胞凋亡。
　　 二、X射線引起L02細(xì)胞停滯于G0/G1期,NAD+使L02細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制。
　　 三、NAD+能夠減少細(xì)胞受照射后p53、bax表達(dá),上調(diào)bcl-2的表達(dá)。能夠降低細(xì)胞受照射后Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性的表達(dá)。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過觀察氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)對(duì)輻射損傷的人正常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞的影響表明:NAD+能夠?qū)筙