人類肝臟組織中miRNa-660、miRNA-27b與CYP3A4表達(dá)的相關(guān)性研究.pdf

1、CYP3A4是人類最重要的Ⅰ相藥物代謝酶，約占成人肝臟中藥物代謝酶的60％，參與半數(shù)以上臨床用藥的體內(nèi)代謝過程，且CYP3A4的酶活性決定其靶藥物的體內(nèi)代謝速率。CYP3A4的表達(dá)受到環(huán)境和遺傳因素的共同影響，但CYP3A4酶活性個(gè)體差異的90％來源于遺傳因素，現(xiàn)有基因變異的研究結(jié)果不能充分解釋CYP3A4的個(gè)體化差異。miRNA作為基因轉(zhuǎn)錄后的重要調(diào)控因子，有研究從細(xì)胞水平證實(shí)了miRNA-27b能直接作用于CYP3A4的3'-UTR

2、，下調(diào)CYP3A4的表達(dá)，但關(guān)于miRNA-27b是否在人類肝臟中調(diào)控CYP3A4的表達(dá)未做出確切解答，其他的miRNA在CYP3A4表達(dá)調(diào)控中的作用還知之甚少。
　　研究目的
　　篩查可能調(diào)控CYP3A4基因表達(dá)的miRNA，及其在人類肝臟組織中對(duì)CYP3A4的mRNA、蛋白水平和酶活性的影響;探討miRNA-27b是否在人類肝臟組織中調(diào)控CYP3A4表達(dá)水平。
　　方法和結(jié)果
　　(1)采用三種軟件預(yù)測可能作

3、用于CYP3A4基因3'-UTR的miRNA，共預(yù)測出108種miRNA。
　　(2)通過高通量轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和熒光色素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)從108種miRNA中篩選出陽性miRNA12種。并從中選擇了miRNA-660做進(jìn)一步的功能驗(yàn)證，miRNA-660可明顯抑制螢光素酶活性，使其降低35％。
　　(3)收集到28例人類肝臟組織，通過LNA標(biāo)記的miRNA特異引物及SYBRGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測miRNA-660和miRNA

4、-27b在肝臟組織中的表達(dá)量，結(jié)果顯示兩種miRNA的表達(dá)水平在28個(gè)樣本中存在明顯差異。
　　(4)SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測肝臟組織中CYP3A4的mRNA量，western blot檢測CYP3A4蛋白量，HPLC檢測CYP3A4酶活性，將三種表達(dá)水平與miRNA-660、miR-27b的表達(dá)值進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示miRNA-660與肝臟組織中CYP3A4的蛋白、酶活性顯著負(fù)相關(guān)(p＜0.05)，與mRN