西洋參莖葉總皂苷抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡改善大鼠急性心肌梗死后心室重構(gòu)的研究.pdf

1、急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后心室重構(gòu)(ventricularremodeling，VR)包括梗死區(qū)擴展、心室擴張和非梗死區(qū)代償性肥厚，是引起AMI后心衰的病理基礎(chǔ)，與缺血后心肌細胞凋亡、肥大、延長、側(cè)向滑移及心肌間質(zhì)纖維化等密切相關(guān)。心肌缺血觸發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulumstress，ERS)是引起細胞凋亡的主要信號通路。ERS信號通路能誘導(dǎo)C/EBP同源

2、蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，誘導(dǎo)促凋亡基因表達。我們前期研究證實，CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡途徑，參與大鼠心肌缺血/再灌注損傷及心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷。CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡，是否參與AMI后心室重構(gòu)的病理過程？尚缺少研究報道。
　　 我們前期研究發(fā)現(xiàn)，西洋參莖葉總皂苷(Panax quinquefolium saponin，PQS)可通過抑制炎癥反應(yīng)、降低神經(jīng)內(nèi)

3、分泌因子的激活、調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)代謝等改善AMI后VR; PQS可改善大鼠心肌缺血再灌注損傷，減輕離體大鼠心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷，其機制和抑制過度ERS有關(guān)。PQS改善AMI后VR的作用，是否與抑制CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡有關(guān)？以往亦缺少研究。
　　 因此，本研究采用結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支建立AMI模型，進一步證實PQS改善AMI后VR的作用，并從CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡方面，探討PQS改善AMI后VR的分子機制;采用內(nèi)

4、質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)誘導(dǎo)離體乳大鼠心肌細胞ERS相關(guān)凋亡，觀察PQS對TG誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的影響;以蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)重組腺病毒感染和RNA干擾(RNA interference，RNAi)方法分別過表達或敲低心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)跨膜蛋白PERK基因，探討PQS抑制ERS相關(guān)

5、凋亡的信號途徑。
　　 研究一西洋參莖葉總皂苷改善急性心肌梗死后心室重構(gòu)的作用
　　 目的:證實西洋參莖葉總皂苷對AMI后心室重構(gòu)的改善作用
　　 方法:通過結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支復(fù)制急性心肌梗死模型，術(shù)后24 h，存活的大鼠隨機分為PQS50 mg/kg/d組、PQS100 mg/kg/d組、PQS200 mg/kg/d組、?；撬?00 mg/kg/d組及AMI組（等量飲用水灌胃），每組10只。另設(shè)sham組

6、（等量飲用水灌胃）15只。4周后，超聲心動圖檢測左室結(jié)構(gòu)及功能變化、頸動脈插管檢測血流動力學(xué)、BIOSITE Triage診斷儀測定血漿BNP含量、Evansblue和TTC染色法測定心肌梗死范圍、比色法測定非梗死區(qū)心肌組織羥脯氨酸含量。
　　 結(jié)果:與AMI組比較，低、中、高劑量PQS均可明顯降低收縮期及舒張期左室內(nèi)徑、左室舒張末壓、血漿BNP水平、心肌梗死范圍和心肌組織羥脯氨酸含量(P＜0.05），升高射血分數(shù)、左室短軸縮短

7、率、平均頸動脈壓、左室收縮末壓和+dp/dtmax及-dp/dtmax絕對值(P＜0.05），且呈劑量依賴性。
　　 結(jié)論:PQS減輕AMI后大鼠心臟結(jié)構(gòu)變化、功能損傷和纖維化程度，減輕AMI后心室重構(gòu)。
　　 研究二西洋參莖葉總皂苷抑制AMI后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡的作用
　　 目的:證實西洋參莖葉總皂苷抑制AMI后ERS相關(guān)凋亡的作用。
　　 方法:AMI造模后24 h，存活大鼠分組（每組10只）:AMI

8、組（等量飲用水灌胃），PQS200 mg/kg/d組、?；撬峤M(300 mg/kg/d)，另設(shè)sham組15只。4周后，TUNEL法檢測非梗死區(qū)心肌細胞凋亡率，Western blotting檢測ERS分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、鈣網(wǎng)蛋白(CRT)、CHOP及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達。
　　 結(jié)果:與AMI組比較，PQS200 mg/kg/d組非梗死區(qū)心肌細胞凋亡率、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78和CRT蛋白表達

9、、ERS凋亡相關(guān)分子CHOP和促凋亡蛋白Bax表達均明顯降低(P＜0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2明顯升高(P＜0.05)。Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，CHOP蛋白表達與心肌細胞凋亡率呈顯著正相關(guān)(r=0.797，P＜0.01)。
　　 結(jié)論:PQS通過抑制CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡而減輕AMI后非梗死區(qū)心肌細胞凋亡。
　　 研究三西洋參莖葉總皂苷減輕毒胡蘿卜素誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的作用
　　 目的:證實PQS減

10、輕ERS誘導(dǎo)劑TG誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的作用。
　　 方法:原代培養(yǎng)的心肌細胞分為:①Control組:細胞置CO2孵箱37℃，常規(guī)培養(yǎng)24 h。②TG組:培養(yǎng)液中加1μMTG，作用24h;③、④、⑤、⑥組:分別采用40μg/ml、80μg/ml及160μg/ml PQS及牛磺酸40mM預(yù)處理細胞24 h后，再向培養(yǎng)液中加入1μM TG作用24h。CCK-8法和流式細胞術(shù)檢測細胞活性及凋亡率，Western blotting方法檢測

11、ERS標志分子GRP78、PERK、CHOP及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達。
　　 結(jié)果:與TG組比較，PQS160μg/ml可顯著降低細胞凋亡率，升高細胞比活力(P＜0.05）;三種不同濃度的PQS均可降低GRP78、PERK、CHOP及Bax蛋白表達，升高Bcl-2蛋白表達(P＜0.05），且呈劑量依賴性。
　　 結(jié)論:PQS160μg/ml減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，其機理可能與抑制過

12、度ERS相關(guān)凋亡有關(guān)。
　　 研究四西洋參莖葉總皂苷抑制PERK介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑的作用
　　 目的:證實PQS通過抑制PERK-eIF2α-ATF4-CHOP減輕心肌細胞凋亡。
　　 方法:原代培養(yǎng)的心肌細胞分為:①Control組:細胞置CO2孵箱37℃，常規(guī)培養(yǎng)24 h。②TG組:培養(yǎng)液中加1μMTG，作用24 h;③PQS+TG組:160μg/mlPQS預(yù)處理24 h后，按照②程序操作;④PER

13、K敲低+TG組:以RNAi方法敲低心肌細胞PERK基因后，按照②程序操作;⑤隨機雙鏈RNA轉(zhuǎn)染對照組+TG組(MOCK+TG):轉(zhuǎn)染隨機合成的25bp雙鏈小RNA片段至心肌細胞后，按照②程序操作;⑥PERK過表達組:以PERK重組腺病毒感染24 h;⑦PQS+PERK過表達組:培養(yǎng)液中加入終濃度為160μg/ml的PQS預(yù)處理24 h后，按照⑥程序操作。以CCK-8法和流式細胞術(shù)分別檢測細胞活性及凋亡率;RT-PCR和Western b

14、lotting方法檢測ERS標志分子GRP78、PERK、eIF2α、ATF4和CHOP的轉(zhuǎn)錄及翻譯。
　　 結(jié)果:與單純TG處理組比較，敲低PERK表達及PQS預(yù)處理均可顯著降低心肌細胞凋亡率，提高細胞比活力，降低ERS分子GRP78、ATF4及CHOP表達，降低PERK及eIF2α的磷酸化水平(P＜0.05)。與Control組比較，單純過表達PERK可升高心肌細胞凋亡率，降低心肌細胞比活力，升高ERS分子GRP78、ATF