西洋參莖葉總皂苷減輕心肌缺血-再灌注損傷的研究.pdf

1、盡早恢復組織血供，是目前防治心肌缺血損傷最有效的措施。但研究發(fā)現(xiàn)，缺血一定時間的心肌在重新恢復血液供應后，損傷反而加重，出現(xiàn)心肌頓抑、心功能低下、惡性心律失常等，即心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷。隨著急性心肌梗死(AMI)溶栓、經(jīng)皮穿刺冠狀動脈腔內血管成型術和冠狀動脈旁路手術等再灌注療法的廣泛應用，心肌再灌注損傷成為心血管領域研究的熱點之一。
　　上世紀九十年代以來，我國對西洋參莖葉化學成

2、分和藥理學作用進行了大量研究，表明其化學成分包括皂苷類、氨基酸類、糖類、揮發(fā)油類、無機元素類和脂肪酸類等。西洋參莖葉總皂苷(panax quinquefolium saponins，PQS)是從西洋參莖葉中提取出的活性成分。研究顯示，PQS具有抗I/R心肌細胞凋亡、維持細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)等作用。
　　內質網(wǎng)(endoplasmie reticulum，ER)為細胞中調控蛋白質折疊、Ca2+穩(wěn)態(tài)的細胞器之一，對應激非常敏感，缺血缺氧

3、、葡萄糖/營養(yǎng)物質匱乏、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)耗竭、大量自由基產(chǎn)生及Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞等均可引起內質網(wǎng)功能障礙，觸發(fā)內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。一定程度的ERS通過上調葡萄糖調節(jié)蛋白類(glucose-regulated proteins，GRPs)、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)、蛋白質折疊酶等促進內質網(wǎng)功能恢復，持續(xù)或嚴重的E

4、RS則破壞細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)、上調促凋亡因子CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein，CHOP)及caspase12的表達和活化，誘導ERS相關細胞凋亡，加重I/R損傷。
　　本研究采用大鼠心肌I/R模型及心肌細胞缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)模型，模擬在體心肌I/R損傷，研究西洋參莖葉總皂苷保護心肌I/R

5、損傷的作用，并從內質網(wǎng)應激方面，探討可能的分子機理。研究分為以下三個部分：
　　研究一西洋參莖葉總皂苷對于心肌缺血/再灌注損傷的影響
　　目的：觀察西洋參莖葉總皂苷(PQS)對心肌I/R損傷的作用。
　　方法：采用SD大鼠在體心臟I/R模型，檢測血流動力學及血清心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)含量，以TTC和伊文思藍雙染法檢測心梗面積，采用HE和TUNEL法分別評估心肌病理損傷和心肌細胞

6、凋亡程度，采用Westernblot法檢測心肌組織凋亡調節(jié)因子的表達。采用乳鼠心肌細胞缺氧/復氧(H/R)損傷模型，以臺盼藍排斥實驗、乳酸脫氫酶活性以及流式細胞術檢測細胞損傷及凋亡情況，以RT-PCR和Western blot方法，檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達。
　　結果：(1)動物實驗結果：與Sham組比較，I/R組平均動脈壓升高55.0％(P<0.05)，左室收縮與舒張功能(±dp/dtmax)分別降低42.0％和

7、43.0％(P<0.05)，血清cTnT含量為Sham組的3.9倍(P<0.05)，梗死區(qū)心肌/缺血區(qū)面積(area of necrosis/area at risk，AN/AAR)百分比為(44.2±1.4)％，心肌細胞凋亡指數(shù)是Sham組的7.0倍(P<0.05)。病理觀察表明，心肌纖維結構紊亂，局部呈斷裂、壞死融合?？沟蛲龅鞍譈cl-2表達降低54.9％(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達是Sham組的3.9倍(P<0.05)；

8、與I/R組比較，PQS+I/R組平均動脈壓降低32.0％(P<0.05)，左室+dp/dtmax分別升高64.0％和35.0％(P<0.05)，血清cTnT含量降低53.3％(P<0.05)，AN/AAR百分比降低65.5％(P<0.05)，心肌細胞凋亡率降低54.9％(P<0.05)；心肌組織病理損傷程度減輕；抗凋亡蛋白Bcl-2表達升高110.0％(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達降低47.8％(P<0.05)。
　　(2

9、)細胞實驗結果：與對照組比較，H/R組心肌細胞凋亡率升高5.0％(P<0.05)，細胞存活率降低21.7％(P<0.05)，LDH活性較對照組高約6.0倍(P<0.05)。Bcl-2 mRNA和蛋白表達分別降低44.5％和58.3％(P<0.05)，Bax mRNA和蛋白表達分別升高86.9％和167.0％(P<0.05)；和H/R組比較，PQS+H/R組細胞凋亡率降低4.2％(P<0.05)，存活率升高21.2％(P<0.05)，LD

10、H活性降低66.6％(P<0.05)。Bcl-2 mRNA和蛋白的表達分別升高30.9％和48.0％(P<0.05)，Bax mRNA和蛋白的表達分別降低39.7％和48.4％(P<0.05)。
　　結論：PQS可減輕心肌缺血/再灌注損傷，其機制與增加抗凋亡因子Bcl-2和降低促凋亡因子Bax的表達有關。
　　研究二西洋參莖葉總皂苷減輕心肌缺血，再灌注損傷致嚴重內質網(wǎng)應激的研究
　　目的：觀察西洋參莖葉總皂苷(PQS)

11、對心肌I/R損傷致嚴重ERS的影響。
　　方法：采用SD大鼠在體心臟缺血/再灌注(I/R)模型和乳鼠心肌細胞缺氧/復氧(H/R)模型，以RT-PCR和Western blot方法，分別檢測內質網(wǎng)應激相關因子的表達。
　　結果：(1)動物實驗結果：與Sham組比較，I/R組GRP78、CRT蛋白表達分別為Sham組的3.1倍和3.0倍(P<0.05)，CHOP蛋白表達為Sham組的3.4倍(P<0.05)，剪切后的caspas

12、e12的蛋白表達是Sham組的2.5倍(P<0.05)；與I/R組比較，PQS+I/R組CRT蛋白表達降低43.4％(P<0.05)，CHOP蛋白表達和剪切后的caspase-12蛋白表達分別降低38.6％和23.7％(P<0.05)。
　　(2)細胞實驗結果：與對照組比較，H/R組GRP78 mRNA和蛋白的表達分別升高380.0％和142.0％(P<0.05)，CRT mRNA和蛋白的表達分別升高96.0％和312.0％(P<

13、0.05)；CHOP mRNA和蛋白的表達分別升高311.0％和219.0％(P<0.05)；剪切后的caspase-12蛋白表達升高180.0％(P<0.05)；與H/R組比較，PQS+H/R組GRP78 mRNA和蛋白的表達分別降低61.6％和37.7％(P<0.05)，CRT mRNA和蛋白的表達分別降低35.7％和52.2％(P<0.05)；CHOPmRNA和蛋白的表達分別降低57.0％和51.7％(P<0.05)；剪切后的ca

14、spase-12蛋白表達降低34.9％(P<0.05)。
　　結論：PQS可減輕心肌I/R誘導的嚴重ERS，表現(xiàn)為降低I/R后CRT的過表達，抑制CHOP、easpase-12等內質網(wǎng)凋亡通路的激活，減少過度ERS介導的細胞凋亡。
　　研究三西洋參莖葉總皂苷減輕心肌缺血/再灌注損傷致嚴重內質網(wǎng)應激的下游信號通路研究
　　目的：探討西洋參莖葉總皂苷(PQS)減輕大鼠心肌I/R損傷致嚴重ERS的機制。
　　方法：采用

15、SD大鼠在體心臟缺血/再灌注(I/R)模型，檢測血流動力學及血清cTnT含量，以TTC和伊文思藍雙染法檢測心梗面積，采用HE和TUNEL法分別評估心肌病理損傷和心肌細胞凋亡程度，按CaN測試盒步驟測定心肌CaN活性，采用Western blot法檢測心肌組織CaN蛋白表達；采用乳鼠心肌細胞缺氧/復氧(H/R)損傷模型，轉染pCDB-CaN質?；駽aN抑制劑FK506干擾CaN表達，以流式細胞術檢測細胞凋亡，按CaN測試盒步驟測定心肌細胞

16、CaN活性，以Western blot方法，檢測心肌細胞CaN表達。
　　結果：(1)動物實驗結果：與PQS+I/R組比較，CaN抑制劑(PQS+CaN+I/R)組平均動脈壓、左室收縮舒張功能(±dp/dtmax)、血清cTnT含量、心梗面積、心肌細胞凋亡率、抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax表達、CaN活性及蛋白表達無顯著差異(P>0.05)。
　　(2)細胞實驗結果：與PQS+H/R組比較，CaN抑制劑(FK506)