西洋參莖葉總皂苷對冠心病胰島素敏感性影響及其作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：IR是聯(lián)系冠心病、糖尿病、高血壓、血脂異常等多種代謝相關(guān)疾病的共同病理生理基礎(chǔ)。大量研究表明，IR可通過繼發(fā)高胰島素血癥、糖脂質(zhì)代謝異常、高血壓、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、SMC增生、血小板活化、凝血/纖溶系統(tǒng)異常等途徑，參與CHD的發(fā)病，是CHD的重要危險(xiǎn)因素之一。重視胰島素抵抗的處理、增加機(jī)體胰島素敏感性有助于改善代謝異常并減輕血管病變。冠心病的防治思想不僅在于改善血管壁的病變、增強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性，還應(yīng)注意早期干預(yù)，改善胰島素抵

2、抗。 西洋參莖葉總皂苷(Panaxquinquefoliussaponin，PQS)是從國產(chǎn)西洋參莖葉中提取的活性成分，其莖葉部總皂苷、氨基酸、無機(jī)元素含量明顯高于根部。1999年衛(wèi)生部組織全國十家三甲醫(yī)院進(jìn)行西洋參莖葉皂苷制劑治療冠心病和糖尿病的多中心雙盲對照的臨床觀察，證明PQS確實(shí)同時(shí)具有調(diào)整脂質(zhì)代謝、降低血糖和改善心肌缺血的作用，這在現(xiàn)代西醫(yī)學(xué)的治療藥物中尚不多見。那么，該藥調(diào)脂降糖機(jī)制是什么?是否存在共同機(jī)制?其作用是

3、否是通過增加胰島素敏感性、改善胰島素抵抗而實(shí)現(xiàn)的?為此，本課題實(shí)驗(yàn)研究將從糖--脂代謝的密切聯(lián)系出發(fā)，以胰島素抵抗為中心，以脂肪細(xì)胞為模型來研究PQS調(diào)控的糖脂代謝，從脂肪細(xì)胞分化、脂肪分解以及對葡萄糖消耗和胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等不同環(huán)節(jié)尋找西洋參莖葉總皂苷調(diào)脂降糖的作用靶點(diǎn)和作用途徑，將為該藥防治冠心病、糖尿病等代謝相關(guān)疾病提供可參考的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。臨床研究將對其是否能夠增加冠心病血糖異?；颊邔σ葝u素的敏感性、改善其IR狀態(tài)和糖脂代謝，從而發(fā)揮

4、對冠心病的治療作用進(jìn)行驗(yàn)證；并初步探討冠心病血糖異?；颊咭葝u素敏感性變化與中醫(yī)證型的關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)研究[實(shí)驗(yàn)一]目的：觀察西洋參莖葉總皂苷(PQS)對3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中過氧化物酶體增殖體激活受體-γ(PPAR-γ)基因表達(dá)的影響。方法：培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，用含胰島素、異丁基-甲基-黃嘌呤(IMX)和地塞米松的培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，采用相差顯微鏡觀察活細(xì)胞形態(tài)，用油紅O染色法進(jìn)行細(xì)胞鑒定、檢測脂肪細(xì)胞分化過程中脂

5、肪的堆積，采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測培養(yǎng)細(xì)胞中PPAR-γmRNA的表達(dá)。結(jié)果未誘導(dǎo)組在0、5、7、9天均未檢測到PPAR-γmRNA，誘導(dǎo)組及各藥物處理組則在5、7、9天均可見PPAR-γmRNA，且與單純誘導(dǎo)組相比，二甲雙胍及PQS三個(gè)劑量均有促進(jìn)PPAR-γ基因轉(zhuǎn)錄的趨勢，但統(tǒng)計(jì)分析未達(dá)明顯差異(P＞0.05)。誘導(dǎo)組和各藥物處理組第9天PPAR-γmRNA量比第5、第7天低。 [實(shí)驗(yàn)二]目的：觀察西洋

6、參莖葉總皂苷(PQS)對脂肪細(xì)胞胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子-4(GLUT-4)轉(zhuǎn)位和c-cb1結(jié)合蛋白(CAP)基因表達(dá)的影響。方法：將3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞，用游離脂肪酸(FFA)制備胰島素抵抗(IR)模型，用液閃儀測定3H標(biāo)記的葡萄糖的攝取率，用免疫熒光法檢測GLUT-4轉(zhuǎn)位，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測培養(yǎng)細(xì)胞中CAPmRNA的表達(dá)。結(jié)果模型組胰島素刺激下的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率為2.14

7、3±0.472，顯著低于正常對照組4.993±0.917(P＜0.01)，二甲雙胍組、PQS大/中劑量組葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率分別為4.180±0.717、3.942±0.492、3.160±0.450，與模型組相比差異顯著(P＜0.01)(P＜0.01)(P＜0.05)，PQS小劑量組作用不明顯。模型組在胰島素刺激前后，GLUT-4在細(xì)胞內(nèi)的分布無明顯變化；而正常對照組在胰島素刺激前，GLUT-4大部分位于胞漿，胰島素刺激30min后，胞漿內(nèi)的

8、分布較刺激前明顯減少，胞膜上分布相對增加。二甲雙胍組和PQS三個(gè)劑量組的結(jié)果與正常組相近。與正常組相比，模型組CAPmRNA水平明顯下降(P＜0.05)，經(jīng)二甲雙胍或PQS大、中劑量處理后，CAPmRNA水平明顯上升，與模型組相比差異顯著(P＜0.01)，PQS小劑量未見明顯效果。結(jié)論P(yáng)QS能夠促進(jìn)脂肪細(xì)胞CAP基因轉(zhuǎn)錄、GLUT-4轉(zhuǎn)位和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，這可能與其改善脂肪細(xì)胞IR的作用有關(guān)，但PQS“促進(jìn)GLUT-4轉(zhuǎn)位和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)”這一

9、作用是藥物的直接效應(yīng)還是通過影響FFA而發(fā)揮的間接效應(yīng)還有待進(jìn)一步的研究來證實(shí)。 [實(shí)驗(yàn)三]目的：觀察西洋參莖葉總皂苷(PQS)對脂肪細(xì)胞胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及糖脂代謝的影響。方法將3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞，用游離脂肪酸(FFA)誘導(dǎo)制備胰島素抵抗(IR)模型，再加入相應(yīng)藥物作用，最后用western-blot法檢測胰島素刺激后信號蛋白磷酸化水平，用葡萄糖氧化酶法檢測藥物作用后脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖

10、消耗量，用比色法檢測藥物對腫瘤壞死因子-a(TNF-a)的脂解作用的影響。結(jié)果模型組胰島素受體β亞單位酪氨酸磷酸化水平、IRS-1酪氨酸磷酸化水平、PKB的Ser473磷酸化水平均較正常對照組減低；PQS小劑量組與模型組相比，信號蛋白磷酸化水平無明顯差異；但與模型組相比，PQS中、大劑量和二甲雙胍組信號蛋白磷酸化水平均有不同程度地增高。模型組葡萄糖消耗量為5.250±2.671，顯著低于正常對照組14.133±1.305(P＜0.01)

11、，二甲雙胍組、PQS大/中/小劑量組葡萄糖消耗量分別為11.807±1.358、10.784±2.373、10.217±1.237、9.984±2.006，與模型組相比均差異極顯著(P＜0.01)，且隨著PQS用藥劑量的增加，葡萄糖消耗量也逐漸增加。TNF-a組培養(yǎng)液中FFA濃度(2.479±0.597)顯著高于對照組(1.320±0.538)(P＜0.01)，予二甲雙胍和西洋參莖葉總皂苷大/中/小三個(gè)劑量處理后，培養(yǎng)液中FFA濃度均顯

12、著低于TNF-a組(P＜0.01)，分別為1.210±0.566、1.105±0.631、1.108±0.260、1.201±0.593，但各藥物治療組間相比FFA無顯著差異，且隨著PQS用藥劑量的加大，其抗脂解作用有逐漸增強(qiáng)的趨勢。結(jié)論FFA誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗，此時(shí)，胰島素刺激下的胰島素受體β亞單位酪氨酸磷酸化水平、信號蛋白IRS-1酪氨酸磷酸化水平和PKB的Ser473磷酸化水平降低，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受阻，脂肪細(xì)胞攝取利用葡萄糖

13、障礙，葡萄糖消耗量減少，PQS中、大劑量和二甲雙胍均可不同程度地升高信號蛋白磷酸化水平，促進(jìn)脂肪細(xì)胞利用葡萄糖，但PQS所致的胰島素受體后改變是藥物的直接效應(yīng)還是通過影響FFA而發(fā)揮的間接效應(yīng)?還有進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來證實(shí)。 臨床研究：目的：觀察PQS對冠心病血糖異常患者血糖、血脂及胰島素敏感性的影響，初步探討冠心病血糖異?；颊咭葝u素敏感性變化與中醫(yī)證型的關(guān)系。方法：選擇冠心病心絞痛并血糖異常(IFG/IGT/T2DM)患者84例

14、，隨機(jī)分為PQS組(43例)和常規(guī)西藥治療組(41例)。PQS組在西藥常規(guī)治療的同時(shí)加口服PQS，連續(xù)用藥治療4周，用藥前后檢測患者FPG、FINS、TC、TG、HDL、LDL，胰島素敏感指數(shù)(ISI)=1/(FPG.FINS)；穩(wěn)態(tài)模型(Homamodel)的胰島素抵抗指數(shù)(Homa-IR)和β細(xì)胞功能(Homa-β)分別為：Homa-IR=(FPG×FINS)/22.5，Homa-β=20×FINS/(FPG-3.5)。結(jié)果：兩組病

15、例在心絞痛療效、心電圖療效及中醫(yī)證候療效比較，無顯著差異。兩組治療后FPG均較治療前顯著下降(P＜0.01)，且PQS組FPG降低程度(25.80±12.72﹪)較常規(guī)西藥治療組(20.89±12.17﹪)稍高，但統(tǒng)計(jì)分析未達(dá)顯著差異(P＞0.05)。提示：在西藥常規(guī)治療的基礎(chǔ)上加用PQS，有進(jìn)一步降低冠心病血糖異?；颊哐堑淖饔泌厔荨山M治療后ISI水平雖均較治療前有所增高、Homa-IR有輕度降低，但統(tǒng)計(jì)分析均未達(dá)明顯差異(P＞0.

16、05)；組間ISI、Homa-IR無差異。治療組治療后Homa-β值(4.19±0.79)較治療前(3.48±0.76)有顯著增加(P＜0.01)，并顯著高于常規(guī)西藥治療組治療后的水平(3.82±0.77)(P＜0.05)；而常規(guī)西藥治療組治療前后Homa-β值無顯著變化，且治療前兩組組間比較Homa-β水平無顯著差異。PQS組治療后TC、LDL水平均較治療前顯著降低(P＜0.05)，且治療后TC水平(1.17±0.54)顯著低于常規(guī)西

17、藥治療組(1.42±0.49)(P＜0.05)；PQS組治療前后TG和HDL水平無明顯變化(P＞0.05)；常規(guī)西藥治療組治療前后TC、LDL、TG和HDL水平均無顯著差異(P＞0.05)。兩組間相比，治療前后TG、LDL、HDL水平均無顯著差異；提示：在常規(guī)西藥治療的基礎(chǔ)上加用PQS，可顯著降低冠心病血糖異?；颊哐猅C、LDL水平，效果優(yōu)于單純西藥治療組。中醫(yī)證型分析表明：冠心病血糖異?；颊邩?biāo)實(shí)證中，ISI由氣滯血瘀→寒凝血瘀→痰濁血