Peroxiredoxin I在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨組織抗氧化損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　 骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)作為一種常見的關(guān)節(jié)疾病，在50歲以上人群中，發(fā)病率高居致殘疾病的第二位，是影響老年人身體健康的常見病和多發(fā)病。OA的主要病理表現(xiàn)為進(jìn)行性的軟骨退變、龜裂和缺損，而周圍軟骨對病損缺乏自愈能力。明確OA持續(xù)進(jìn)展的原因，針對性地采取遏制性治療措施，是突破該疾病保守治療難題的關(guān)鍵所在。
　　 學(xué)術(shù)界對OA關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退變和破壞的原因從不同角度進(jìn)行了大量研究，但其

2、發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。凋亡被認(rèn)為是軟骨退變的關(guān)鍵性病理因素。Mollenhauer和Mok研究發(fā)現(xiàn):凋亡細(xì)胞更多出現(xiàn)在OA軟骨表層，以及軟骨缺損灶周圍。由于OA軟骨缺損都始于軟骨表層且大多存在于軟骨表層，這些凋亡細(xì)胞的異常層間差異分布，被認(rèn)為是軟骨缺損灶周圍組織喪失缺損修復(fù)能力的關(guān)鍵原因。
　　 在OA患者的關(guān)節(jié)腔內(nèi)存在高濃度的的活性氧歧化物(reactive oxygen spesies，ROS)。ROS攻擊軟骨細(xì)胞后，會引發(fā)

3、膜脂質(zhì)過氧化，使脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物增多，這些產(chǎn)物又可直接攻擊軟骨細(xì)胞DNA，影響DNA的合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Loeser和Carlson研究發(fā)現(xiàn)毒性的ROS造成細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)硝化，而這些硝化蛋白質(zhì)多位于OA表層的軟骨細(xì)胞內(nèi)，間接反映出毒性ROS在軟骨組織層間差異分布的現(xiàn)象。這種毒性ROS的存OA軟骨表層聚集的現(xiàn)象，與OA軟骨細(xì)胞凋亡表層聚集現(xiàn)象之間，可能存在著某種因果關(guān)系。
　　 文獻(xiàn)關(guān)于毒性ROS層間差異分布的描述，使ROS

4、的“清道夫”——抗氧化酶Peroxiredoxins(Prxs)家族受到關(guān)注。哺乳動物中至少存在六種Prx亞型(PrxⅠ-Ⅵ)，它們可分為三個亞類:
　　 ①典型2-Cys Prxs(PrxⅠ-Ⅳ);
　　 ②不典型2-Cys Prx(PrxⅤ);
　　 ③1-Cys Prx(PrxⅥ)。
　　 Prxs家族成員均可利用蛋白中巰基提供的還原電子將組織中的氧自由基還原成無毒分子。Prxs通過其本身的過氧化物

5、酶活性在細(xì)胞內(nèi)起抗氧化作用（ROOH+2e—→ROH+H2O），可將機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的氫氧化物、過氧化亞硝酸鹽和許多種有機(jī)氫過氧化物還原或降解，其抗氧化作用能力在某種程度上與谷光甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)和過氧化氫酶(catalase，Cat)相似。Prxs家族廣泛分布于細(xì)胞內(nèi)，其功能涵蓋抗氧化應(yīng)激、促進(jìn)細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。作為細(xì)胞內(nèi)毒性ROS的清除劑和凋亡保護(hù)因子，Prxs在OA軟骨組織

6、中究竟扮演什么角色值得關(guān)注。
　　 課題組前期通過雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析，對正常和OA軟骨組織進(jìn)行差異蛋白研究，發(fā)現(xiàn)在OA軟骨細(xì)胞中，Prxs家族成員之一——PrxⅠ，在OA軟骨組織細(xì)胞中高表達(dá)。理論上，PrxⅠ高表達(dá)賦予軟骨細(xì)胞更強(qiáng)的抗凋亡能力，但是，這種高表達(dá)為什么沒有帶來預(yù)期的凋亡保護(hù)效應(yīng)？PrxⅠ的這種高表達(dá)是否出現(xiàn)在軟骨中毒性ROS最富集的表層？上述諸多問題成為課題組關(guān)注的焦點(diǎn)。因此，本研究擬應(yīng)用蛋白免疫印跡技術(shù)(We

7、stern blot，WB)和免疫組織化學(xué)檢測方法觀察PrxⅠ在正常和OA軟骨中的表達(dá)和分布情況，并通過siRNA敲降軟骨細(xì)胞中的PrxⅠ來模擬其在表層OA軟骨中PrxⅠ的表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象，了解OA軟骨表層細(xì)胞中PrxⅠ下調(diào)表達(dá)對軟骨細(xì)胞耐受毒性ROS和抗凋亡能力的影響，探討PrxⅠ對于OA凋亡軟骨細(xì)胞和毒性ROS表層富集現(xiàn)象的意義，旨在闡釋OA軟骨組織病理改變?nèi)狈ψ杂芰Φ膬?nèi)在原因。
　　 目的:
　　 研究PrxⅠ在正常

8、和OA軟骨中的表達(dá)及分布特點(diǎn)，了解PrxⅠ在OA軟骨組織中是否具備層間分布差異，并通過siRNA敲降軟骨細(xì)胞中的PrxⅠ，模擬PrxⅠ在表層OA軟骨中的表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象，觀察PrxⅠ下調(diào)表達(dá)對軟骨細(xì)胞耐受毒性ROS和抗凋亡能力，探討PrxⅠ對于OA凋亡軟骨細(xì)胞和毒性ROS表層富集現(xiàn)象的意義，旨在闡釋OA軟骨組織病理改變?nèi)狈ψ杂芰Φ膬?nèi)在原因。
　　 方法:
　　 1.觀察PrxⅠ在正常和OA軟骨組織中的表達(dá)及分布特點(diǎn)

9、　　 應(yīng)用WB技術(shù)檢測PrxⅠ在正常與OA軟骨組織中表達(dá)量的總體差異。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法觀察PrxⅠ在正常與OA軟骨組織中的表達(dá)、分布特點(diǎn)，了解PrxⅠ是否存在層間差異分布。
　　 2.人軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
　　 采用酶消化和酶預(yù)消化組織貼塊兩種方法培養(yǎng)原代軟骨細(xì)胞，同時進(jìn)行Ⅱ膠原免疫組化鑒定。
　　 3.驗(yàn)證PrxⅠ在體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中具有抗氧化作用
　　 (1)應(yīng)用Primer3.0軟件設(shè)計(jì)對應(yīng)

10、于PrxⅠ的siRNA。選取分支最高的3個siRNA(序列A:5’-GAU GGU CAG UUU AAA GAU ATT-3';B:5’-GCC GAAUUG UGG UGU CUU ATT-3';C:5’-GGG UCA AUA CAC CUA AGA ATT-3';)進(jìn)行生物合成。應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000承載siRNA轉(zhuǎn)染第2代培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，通過湮滅軟骨細(xì)胞中PrxⅠ mRNA，實(shí)現(xiàn)敲降PrxⅠ表達(dá)的生物效

11、應(yīng)。siRNA序列A、B、C分別轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后72h收獲細(xì)胞，提取可溶性蛋白質(zhì)，應(yīng)用 WB技術(shù)對比觀察轉(zhuǎn)染和正常軟骨細(xì)胞中PrxⅠ的表達(dá)水平，篩選敲降效率最高的siRNA。應(yīng)用上一步篩選的siRNA轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后0h、24h、48h、72h、96h、120h分別收獲細(xì)胞提取可溶蛋白，應(yīng)用 WB技術(shù)對比觀察軟骨細(xì)胞中PrxⅠ的表達(dá)水平，篩選敲降效率最高的 siRNA持續(xù)作用時間點(diǎn)。
　　 (2)軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為正常

12、組和PrxⅠ敲降組，在敲降PrxⅠ效率最高的時間點(diǎn)，應(yīng)用終濃度的0.6mM H2O2分別刺激兩組軟骨細(xì)胞，在刺激持續(xù)0min、90min、180min時間點(diǎn)分別收獲細(xì)胞，應(yīng)用 WB技術(shù)檢測軟骨細(xì)胞中早期凋亡指標(biāo):活性caspase和前體caspse3蛋白含量的差異。同時，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測兩組細(xì)胞在0.6mM H2O2刺激下，在作用持續(xù)0min、30min、90min、180min時間點(diǎn)，軟骨細(xì)胞中annexin V/PI標(biāo)記細(xì)胞的凋亡

13、比例。通過探討PrxⅠ表達(dá)水平下調(diào)對于軟骨細(xì)胞拮抗毒性ROS和相應(yīng)抗凋亡能力的變化，明確OA軟骨表層細(xì)胞中PrxⅠ表達(dá)水平下調(diào)對于表層軟骨凋亡細(xì)胞富集現(xiàn)象之間的關(guān)聯(lián)。
　　 結(jié)果:
　　 1.PrxⅠ在正常和 OA軟骨組織中的表達(dá)及分布特點(diǎn)
　　 (1) WB檢測結(jié)果示:正常組與OA組PrxⅠ蛋白相對表達(dá)量分別為1.014±0.189和3.893±0.693(t=18.34，P＜0.05)，OA軟骨組織細(xì)胞中表達(dá)

14、水平較正常軟骨組織細(xì)胞平均升高2.89倍。
　　 (2)免疫組織化學(xué)染色顯示:PrxⅠ在正常軟骨組織表層、中層和深層中的表達(dá)和分布相對均勻。在中度 OA軟骨組織，PrxⅠ在深層軟骨細(xì)胞中表達(dá)顯著升高，胞漿普遍黃染，顆粒狀著色明顯;在中層軟骨細(xì)胞中，PrxⅠ表達(dá)豐度較深層軟骨細(xì)胞稍弱;在表層軟骨細(xì)胞中，PrxⅠ陽性著色顆粒較少，大部分細(xì)胞胞漿中僅被著色為淡黃色。在重度 OA軟骨組織， PrxⅠ的層間差異表達(dá)在重度OA軟骨組織中表現(xiàn)

15、更為明顯。在磨損和纖維化的軟骨表層，大部分細(xì)胞PrxⅠ染色微弱，甚至缺如;但是，在中層和深層軟骨組織細(xì)胞中，PrxⅠ呈現(xiàn)深棕黃色顆粒，占據(jù)除細(xì)胞核外側(cè)整個細(xì)胞輪廓，同時，在軟骨細(xì)胞周圍還可見PrxⅠ呈云霧狀陽性著色，以旁分泌形式向細(xì)胞周圍基質(zhì)排泄。
　　 2.人軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
　　 酶消化法分離的軟骨細(xì)胞通常在12～24h陸續(xù)貼壁，原代細(xì)胞均勻分布的梭形、多角形，胞漿豐富，圓形的細(xì)胞核居細(xì)胞中央邊緣光滑銳利。酶預(yù)消

16、化組織塊法培養(yǎng)2～3天后可見組織塊上細(xì)胞密集成圓形，部分細(xì)胞開始伸展，細(xì)胞體較瘦小，組織塊周圍未見細(xì)胞爬出，培養(yǎng)第4～5d后，部分組織塊周圍開始有細(xì)胞遷出，之后遷出的細(xì)胞逐漸增多，組織塊周圍爬滿細(xì)胞，呈放射狀生長，細(xì)胞形態(tài)主要為梭形和多角形，胞體較小。原代細(xì)胞消化傳代后，細(xì)胞主要呈梭形或多角形，細(xì)胞體積較原代細(xì)胞增大。第4代軟骨細(xì)胞開始出現(xiàn)去分化的現(xiàn)象，細(xì)胞觸角開始增多，細(xì)胞體積較大，胞漿增多且顆粒增多，核仁肥大，細(xì)胞邊界不清常重疊。原

17、代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)1周后Ⅱ型膠原染色鑒定，細(xì)胞內(nèi)著色為棕黃色，呈陽性。
　　 3.PrxⅠ在體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中抗氧化作用驗(yàn)證
　　 (1)異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染原代軟骨細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4h后，熒光顯微鏡下觀察85％～90％的細(xì)胞呈現(xiàn)陽性熒光，轉(zhuǎn)染效率滿足實(shí)驗(yàn)要求。
　　 (2)采用A、B、C三個 siRNA分別對軟骨細(xì)胞的PrxⅠ基因的表達(dá)進(jìn)行

18、干擾，結(jié)果顯示:在 siRNA作用后72h，A、B、C三組對應(yīng)的 PrxⅠ相對表達(dá)量分別為0.778±0.498、0.318±0.300和0.223±0.129，相對于陰性對照組分別平均降低22.2％(F=459.858, P＜0.001),68.2％(F=459.858, P＜0.001)和77.7％(F=459.858,P＜O.001)，可見，C序列 siRNA具備最佳的 PrxⅠ敲降效率。
　　 (3)后續(xù)試驗(yàn)選擇C序列

19、siRNA敲降軟骨細(xì)胞中PrxⅠ的表達(dá)。結(jié)果顯示，在 siRNA作用24h、48h、72h、96h、120h后，PrxⅠ相對表達(dá)量水平分別為0.837±0.222、0.531±0.015、0.214±0.016、0.314±0.029和0.392±0.020，較陰性對照組平均降低16.3％(F=746.383，P＜0.001)、46.9％(F=746.383，P＜0.001)、78.6％(F=746.383, P＜0.001)、68.6

20、％(F=746.383, P＜0.001)和60.8％(F=746.383,P＜0.001)，可見，序列C siRNA在作用72h時間點(diǎn)，可能獲得最佳的PrxⅠ敲降效能。
　　 (4) PrxⅠ敲降對于軟骨細(xì)胞抗ROS刺激和抗凋亡能力的影響
　　 在接受H2O2刺激后，PrxⅠ敲降組和陰性對照組凋亡細(xì)胞比例均隨著刺激時間的延長而同步增加，但是，在不同的時間點(diǎn)，PrxⅠ敲降組的凋亡細(xì)胞比例均顯著高于陰性敲降對照組。

21、　　 對照組在0.6mM H2O2刺激后90min和180min時間點(diǎn)，前體 caspase3的相對表達(dá)量分別為0.563±0.017和0.326±0.015，兩個時間點(diǎn)較 NC對照前體caspase3水平分別平均降低43.7％(F=2310.82，P＜0.001)和67.4％(F=2310.82，P＜0.001)，而活性 caspase3的相對表達(dá)量為1.218±0.093和4.264±0.118，較NC對照組分別升高21.8％(F

22、=2981.36，P＞0.05)和326.4％(F=2981.36，P＜0.001)。相比之下，PrxⅠ敲降組在90min和180min，前體 caspase3的相對表達(dá)量為0.541±0.011和0.173±0.012，兩個時間點(diǎn)較 NC對照水平分別平均降低42.9％(F=2310.82，P＜0.001)和82.7％(F=2310.82，P＜0.001)，而活性 caspase3相對表達(dá)量為5.543±0.091和7.761±0.10

23、48，較正常組 NC對照分別升高454.3％(F=2981.36，P＜0.001)和676.1％(F=2981.36，P＜0.001)。在90min和180min兩個時間點(diǎn)，敲降組與對照組相比前體 caspase3表達(dá)量分別平均降低3.9％(t=-0.715，P=0.51)和46.9％(t=13.177，P＜0.05)，而敲降組與對照組相比活性caspase3表達(dá)量分別平均升高355.1％（t=-57.332，P＜O.05）和82.0％

24、(t=-38.322，P＜0.05)。
　　 在H2O2作用0min、30min、90min、180min時間點(diǎn)，流式細(xì)胞儀檢測AnnexinV/PI雙染軟骨細(xì)胞，正常對照組早期和晚期凋亡細(xì)胞比例之和分別為4.72％±1.05％、10.43％±1.10％、20.14％±0.89％、30.30％±0.95％，而PrxⅠ敲降組分別為4.83％±0.89％、16.53％±0.90％、30.62％±1.10％、68.54％±1.24％。

25、90min和180min早期和晚期凋亡細(xì)胞比例之和，敲降組較對照組凋亡細(xì)胞率平均增加52.0％(t=-12.779, P=0.03)和126.2％(t=-42.195, P=0.14)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)本研究在前期雙向凝膠電泳研究提示PrxⅠ在OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過 WB證實(shí)上調(diào)表達(dá)，并應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察總體上調(diào)表達(dá)的PrxⅠ在 OA組織中的表達(dá)和分布特點(diǎn)。結(jié)果顯示:雖然PrxⅠ在OA軟