GSK-3β介導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化及大鼠空間記憶障礙.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開：
　　 第一部分
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過激活GSK-3 β誘導(dǎo)tau蛋白過度磷酸化及大鼠空間記憶障礙阿爾茨海默?。ˋlzheimer's Disease，AD）是一種最常見的神經(jīng)退行性疾病。以細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）和細(xì)胞外的老年斑（senile plaques,SPs）形成為主要兩大病理特征。Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，具有促進(jìn)微管蛋白聚

2、合成微管和維持其功能穩(wěn)定的作用。但當(dāng)tau蛋白發(fā)生過度磷酸化時(shí)，將失去其對微管的穩(wěn)定作用，導(dǎo)致神經(jīng)退行性變。自從發(fā)現(xiàn)過度磷酸化的tau蛋白是組成AD 神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）的主要成分后，tau蛋白的研究即成為了熱點(diǎn)。但對于AD中導(dǎo)致tau蛋白過度磷酸化的上游因素一直尚不清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成、折疊，維持鈣穩(wěn)態(tài)的重要場所。細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，未折疊/錯誤折疊蛋白發(fā)生聚集時(shí)，將誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

3、應(yīng)激。大量研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與AD的病理改變密切相關(guān)，在AD 病人腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)，其海馬神經(jīng)元內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)陪伴分子Bip(Bip/GRP78)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的跨膜蛋白PERK、eIF2 α和IRE1 α的磷酸化水平明顯增高。且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可激活A(yù)D-樣tau蛋白異常磷酸化的關(guān)鍵性激酶GSK-3 β。由此提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、tau 異常磷酸化和GSK-3 β之間存在重要聯(lián)系。
　　 目的：為了探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在AD 發(fā)病中的作用及其機(jī)制，在大鼠體內(nèi)以及

4、細(xì)胞水平進(jìn)行了研究，旨在闡明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對tau蛋白磷酸化和大鼠空間記憶的影響及其機(jī)制。
　　 方法：在動物水平采用腦立體定位技術(shù)，給予大鼠（左）側(cè)腦室注射內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑tunicamycin(衣霉素，TM）或thapsigargin(毒胡蘿卜素，TG)，以及聯(lián)合注射GSK-3 β特異性抑制劑SB216763。分別進(jìn)行Morris 水迷宮、免疫印跡、酶活性測定和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，來檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對大鼠空間記憶能力以及tau蛋白磷酸化

5、水平的影響及其機(jī)制。細(xì)胞水平，用thapsigargin 處理HEK293/tau 細(xì)胞，以及同時(shí)聯(lián)合給予不同濃度的SB216763 或轉(zhuǎn)染dnGSK-3 β(dominant-negative GSK-3 β)質(zhì)粒，利用免疫印跡技術(shù)檢測tau蛋白的磷酸化水平及其機(jī)制。
　　 結(jié)果：在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到以下結(jié)果。⑴ Tunicamycin/thapsigargin 誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。⑵ 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致大鼠空間記憶障礙、tau蛋白的

6、過度磷酸化以及GSK-3 β的激活。⑶ 抑制GSK-3 β，可以改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所誘導(dǎo)的大鼠空間記憶障礙及tau蛋白的過度磷酸化。⑷ 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過Akt，F(xiàn)yn和 PTP1B 介導(dǎo)的途徑，激活GSK-3 β。⑸ 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，靜息狀態(tài)下與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白PERK、IRE-1、ATF-6 結(jié)合的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)陪伴分子Bip 游離下來，通過與GSK-3 β、tau蛋白的結(jié)合，導(dǎo)致tau蛋白的過度磷酸化。
　　 由此我們得出以下結(jié)論：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

7、應(yīng)激通過Akt、Fyn和PTP1B 途徑激活GSK-3 β，從而誘導(dǎo)tau蛋白過度磷酸化及其大鼠空間記憶障礙。
　　 第二部分
　　 LiCl 通過抑制GSK-3 β改善thapsigargin 誘導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化微管相關(guān)蛋白tau的異常過度磷酸化參與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展，特別是阿爾茨海默病（Alzheimer's Disease，AD）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激存在于多種神經(jīng)退行性疾病中，且可激活導(dǎo)致tau蛋白過度磷

8、酸化的關(guān)鍵激酶GSK-3 β。
　　 目的：探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對tau蛋白磷酸化水平的影響及其相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：在動物水平，給予大鼠腹腔注射氯化鋰（270mg/kg）兩天，于第二天腹腔注射氯化鋰后兩小時(shí)，采用腦立體定位技術(shù)，給予大鼠（左）側(cè)腦室注射thapsigargin（毒胡蘿卜素）。在細(xì)胞水平，給予HEK293/tau 細(xì)胞和SH-SY5Y 細(xì)胞thapsigargin 處理，以及同時(shí)給予不同濃度氯化鋰共孵育。利用

9、蔗糖梯度離心及細(xì)胞體外孵育方法，分別將從HEK293/wt 細(xì)胞中提取的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（應(yīng)激狀態(tài)下（thapsigargin 處理）和非應(yīng)激狀態(tài)下（等量DMSO 處理）的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)），與HEK293/tau 細(xì)胞的胞漿進(jìn)行體外孵育，利用免疫印跡技術(shù)對tau蛋白磷酸化水平及GSK-3 β活性檢測。
　　 結(jié)果：在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到以下結(jié)果。⑴ 在動物和細(xì)胞水平，thapsigargin 通過降低GSK-3 βSer-9位點(diǎn)的磷酸化水平，增加G