從Tau蛋白過(guò)度磷酸化探討宮內(nèi)窘迫后新生鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的分子機(jī)制和預(yù)防措施.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述：
　　第一部分不同程度和時(shí)間阻斷子宮動(dòng)脈對(duì)鼠海馬組織內(nèi)Glu的濃度的影響
　　目的:觀察不同程度和時(shí)間阻斷子宮動(dòng)脈的宮內(nèi)窘迫干預(yù)對(duì)胎鼠海馬Glu濃度的影響。
　　方法:建立宮內(nèi)窘迫的大鼠模型，采用3×3析因設(shè)計(jì):阻斷子宮動(dòng)脈的程度（3水平:輕度阻斷、中度阻斷、完全阻斷）和阻斷時(shí)間（3水平:5min、10min、15min）的所有組合。隨機(jī)將72只大鼠分為9個(gè)組(n=8):LL組（輕度阻斷

2、，5min）;LM組(輕度阻斷，10min);LH組(輕度阻斷，15 min);ML組（中度阻斷，5min）;MM組（中度阻斷，10 min）;MH組（中度阻斷，15 min）;HL組(完全阻斷，5 min);HM組(完全阻斷，10 min);HH組(完全阻斷，15 min)。全部胎兒宮內(nèi)窘迫制模結(jié)束后，剖宮取出胎鼠，留取海馬，高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)檢測(cè)G

3、lu在海馬中的含量。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強(qiáng)應(yīng)激后胎鼠海馬組織內(nèi)Glu濃度明顯升高，而且海馬組織中Glu濃度隨阻斷子宮動(dòng)脈的程度和阻斷時(shí)間而增加。提示我們?cè)谂R床治療中應(yīng)積極改善子宮動(dòng)脈的供血，可減輕胎兒宮內(nèi)窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強(qiáng)應(yīng)激后的胎兒機(jī)體神經(jīng)細(xì)胞損傷。
　　第二部分NMDA受體拮抗劑和AMPA受體拮抗劑對(duì)宮內(nèi)窘迫后新生鼠學(xué)習(xí)記憶障礙和Tau蛋白過(guò)度磷酸化的影響
　　目的:通過(guò)對(duì)GluR拮抗劑對(duì)

4、宮內(nèi)窘迫后新生鼠學(xué)習(xí)記憶能力和對(duì)Tau蛋白過(guò)度磷酸化程度觀察，分析GluR拮抗劑對(duì)新生鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其可能機(jī)制的分析。
　　方法:采用2×3析因設(shè)計(jì):宮內(nèi)窘迫是和否（2水平:否、宮內(nèi)窘迫即中度阻斷孕鼠的子宮動(dòng)脈持續(xù)10min）和GluR拮抗劑使用和否（3水平:注射生理鹽水、NMDA受體拮抗劑MK-801、AMPA受體拮抗劑DNQX）的所有組合。隨機(jī)將48只孕鼠隨機(jī)6個(gè)實(shí)驗(yàn)組(n=8):S組（經(jīng)尾靜脈注射2ml生理鹽水）、M

5、組（經(jīng)尾靜脈注射2ml NMDA受體拮抗劑MK-8015 mg/kg）、D組（經(jīng)尾靜脈注射2ml AMPA受體拮抗劑DNQX5 mg/kg）、SE組（經(jīng)尾靜脈注射2 ml生理鹽水+施行宮內(nèi)窘迫即中度阻斷孕鼠的子宮動(dòng)脈持續(xù)10min）、ME組（經(jīng)尾靜脈注射2 ml NMDA受體拮抗劑MK-8015 mg/kg+施行胎兒宮內(nèi)窘迫即中度阻斷孕鼠的子宮動(dòng)脈持續(xù)10min）、DE組（經(jīng)尾靜脈注射2 ml AMPA受體拮抗劑DNQX5 mg/kg+

6、施行胎兒宮內(nèi)窘迫即中度阻斷孕鼠的子宮動(dòng)脈持續(xù)10min）。全部宮內(nèi)窘迫處置結(jié)束后母鼠繼續(xù)妊娠至足月，剖宮娩出新生鼠，待新生鼠生長(zhǎng)至12W時(shí)進(jìn)行Morris水迷宮(Morris water maze，MWM)檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力，檢測(cè)后麻醉下處死新生鼠留取海馬組織。高效液相色譜法(HPLC)法檢測(cè)Glu在海馬組織內(nèi)的濃度;免疫組化SP(immunohistochemistry，IHC-SP)法檢測(cè)Tau蛋白5（總Tau蛋白）以及磷酸化Tau蛋

7、白p-PHF1Ser396/404、p-AT8Ser199/202、p-12E8Ser262在海馬組織中的表達(dá)狀況。
　　結(jié)論: Glu受體的拮抗劑可以緩解胎兒宮內(nèi)窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強(qiáng)應(yīng)激后的神經(jīng)細(xì)胞損傷，其具體機(jī)制和阻斷興奮性毒性和緩解海馬組織內(nèi)Tau蛋白的超磷酸化程度有關(guān)。
　　第三部分宮內(nèi)窘迫后新生鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的預(yù)防措施
　　實(shí)驗(yàn)一:黃芪總苷對(duì)宮內(nèi)窘迫后新生鼠海馬組織中Glu濃度的影響
　　目的:通過(guò)觀察

8、黃芪總苷對(duì)宮內(nèi)窘迫模型后新生鼠海馬組織內(nèi)Glu濃度的影響。
　　方法:按2×2析因設(shè)計(jì)設(shè)置:宮內(nèi)窘迫是否（2水平:否、施行宮內(nèi)窘迫即中度阻斷孕鼠的子宮動(dòng)脈持續(xù)10min）和黃芪總苷有無(wú)（2水平:尾靜脈注射5 ml生理鹽水或5 ml黃芪總苷40 mg/kg）的所有組合。40只24 W健康雌性SD大鼠建立宮內(nèi)窘迫模型，建模結(jié)束后母鼠繼續(xù)妊娠至新生鼠娩出，待新生鼠生長(zhǎng)至12W時(shí)將32只新生鼠隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組(n=8):S組（尾靜脈注射

9、5 ml生理鹽水）、P組（尾靜脈注射5 ml黃芪總苷40 mg/kg）、SE組(尾靜脈注射5 ml生理鹽水+中度阻斷孕鼠的子宮動(dòng)脈持續(xù)10min)、PE組(尾靜脈注射5 ml黃芪總苷40 mg/kg+中度阻斷孕鼠的子宮動(dòng)脈持續(xù)10min)。全部宮內(nèi)窘迫處置結(jié)束后母鼠繼續(xù)妊娠至足月，剖宮娩出新生鼠，待新生鼠生長(zhǎng)至12W進(jìn)行Morris水迷宮檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)束后取新生鼠的海馬組織。使用HPLC檢測(cè)在新生鼠海馬組織中Glu的含量。
　　結(jié)論

10、:胎兒宮內(nèi)窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強(qiáng)應(yīng)激造成海馬組織內(nèi)Glu濃度過(guò)度升高，進(jìn)而誘發(fā)學(xué)習(xí)記憶功能障礙，而黃芪總苷則可通過(guò)降低海馬組織內(nèi)過(guò)度升高的Glu濃度，從而改善胎兒宮內(nèi)窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強(qiáng)應(yīng)激后的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　實(shí)驗(yàn)二:黃芪總苷和NMDA受體拮抗劑對(duì)宮內(nèi)窘迫后新生鼠學(xué)習(xí)記憶障礙比較研究
　　目的:通過(guò)觀察黃芪總苷和NMDA受體拮抗劑MK-801對(duì)宮內(nèi)窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強(qiáng)應(yīng)激后新生鼠Tau蛋白過(guò)度磷酸化的影響，探討兩者對(duì)Tau

11、蛋白超磷酸化的調(diào)節(jié)，為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　方法:采用2×3析因設(shè)計(jì):宮內(nèi)窘迫是否（2水平:否、中度阻斷孕鼠的子宮動(dòng)脈持續(xù)10min）和藥物（3水平:尾靜脈注射生理鹽水、NMDA受體拮抗劑MK-801、黃芪總苷）的所有組合。隨機(jī)48只宮內(nèi)窘迫模型大鼠隨機(jī)分為6組（n=8）:Ⅰ組（5 ml生理鹽水iv）;Ⅱ組(5mlMK-801 iv，10 mg/kg);Ⅲ組(5ml黃芪總苷iv，200mg/kg);Ⅳ組(5 ml生理鹽水iv

12、+中度阻斷孕鼠的子宮動(dòng)脈持續(xù)10min);Ⅴ組(5 ml MK-801 iv，10 mg/kg+中度阻斷孕鼠的子宮動(dòng)脈持續(xù)10min);Ⅵ組(5ml黃芪總苷iv，200 mg/kg+中度阻斷孕鼠的子宮動(dòng)脈持續(xù)10min)。宮內(nèi)窘迫處置結(jié)束后母鼠繼續(xù)妊娠至足月，剖宮娩出新生鼠，待新生鼠生長(zhǎng)至12W時(shí)麻醉下斷頭取海馬，HPLC法檢測(cè)海馬組織中的Glu的含量，IHC-SP法檢測(cè)海馬組織中p-AT8Ser202和GSK-3β1H8的表達(dá)。

13、>　　結(jié)論:黃芪總苷可以通過(guò)降低海馬Glu濃度減緩Tau蛋白的磷酸化;GSK-3β是該信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白;黃芪總苷改善宮內(nèi)窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強(qiáng)應(yīng)激后的學(xué)習(xí)記憶能力的效果優(yōu)于MK-801。
　　實(shí)驗(yàn)三:黃芪總苷、人參皂苷Rg-1、蛋白磷酸酯酶-2A和氯化鋰對(duì)宮內(nèi)窘迫后新生鼠海馬組織Glu濃度的影響
　　目的:觀察黃芪總苷、人參皂苷Rg-1、蛋白磷酸酯酶-2A和氯化鋰對(duì)宮內(nèi)窘迫后新生鼠海馬內(nèi)Glu濃度和的影響。
　　方法:

14、采用2×5析因設(shè)計(jì):宮內(nèi)窘迫是否（2水平:否、中度阻斷孕鼠的子宮動(dòng)脈持續(xù)10min）和藥物干預(yù)（5水平:通過(guò)子宮動(dòng)脈微量注射生理鹽水、黃芪總苷、人參皂苷Rg-1、蛋白磷酸酯酶-2A、氯化鋰，20μ g·1μL-1）的所有組合。隨機(jī)將80只大鼠分10個(gè)實(shí)驗(yàn)組（n=8）:Ⅰ組（子宮動(dòng)脈注射1μl生理鹽水）;Ⅱ組（子宮動(dòng)脈注射1μl黃芪總苷，20μg）;Ⅲ組（子宮動(dòng)脈注射1μl人參皂苷Rg-120μg）;Ⅳ組（子宮動(dòng)脈注射1μl蛋白磷酸酯酶-

15、2A20μg）;Ⅴ組（子宮動(dòng)脈注射1μl氯化鋰20μg）;Ⅵ組(子宮動(dòng)脈注射1μl生理鹽水+中度阻斷孕鼠的子宮動(dòng)脈持續(xù)10min);Ⅶ組(子宮動(dòng)脈注射1μl黃芪總苷純品，20μg+中度阻斷孕鼠的子宮動(dòng)脈持續(xù)10min);Ⅷ組(子宮動(dòng)脈注射1μl人參皂苷Rg-120μg+中度阻斷孕鼠的子宮動(dòng)脈持續(xù)10min);Ⅸ組(子宮動(dòng)脈微量1μl氯化鋰20μg+中度阻斷孕鼠的子宮動(dòng)脈持續(xù)10min);Ⅹ組（子宮動(dòng)脈注射1μl蛋白磷酸酯酶-2A20μg

16、+中度阻斷孕鼠的子宮動(dòng)脈持續(xù)10min）。
　　結(jié)論:雙黃芪總苷和人參皂苷Rg-1可以用于預(yù)防和治療宮內(nèi)窘迫后學(xué)習(xí)記憶等腦功能障礙;氯化鋰和蛋白磷酸酯酶-2A因?qū)ｑR組織的Glu濃度沒(méi)有明顯影響，不建議用于治療。其原因推測(cè)為四種藥物作用機(jī)制不同造成的，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。
　　全文結(jié)論：
　　1.宮內(nèi)窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強(qiáng)應(yīng)激誘發(fā)海馬谷氨酸濃度升高，子宮動(dòng)脈的阻斷程度和阻斷時(shí)間均可明顯影響這一過(guò)程，兩者作用疊加。

17、r>　　2.宮內(nèi)窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強(qiáng)應(yīng)激誘發(fā)海馬組織內(nèi)的谷氨酸濃度明顯升高，谷氨酸激動(dòng)谷氨酸受體，從而通過(guò)上調(diào)糖原合成酶激酶-3β增加海馬Tau蛋白的磷酸化程度，從而誘發(fā)學(xué)習(xí)記憶障礙。
　　3.谷氨酸受體拮抗劑（例如N-甲基-D-天冬氨酸受體受體拮抗劑MK801）、黃芪總苷通過(guò)降低海馬谷氨酸濃度下調(diào)糖原合成酶激酶-3β的表達(dá)，從而減緩Tau蛋白的磷酸化程度以改善宮內(nèi)窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強(qiáng)應(yīng)激后的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　4.黃芪總苷