βB2-晶體蛋白調(diào)控雄性小鼠生殖功能的機制研究.pdf

1、近年來中國內(nèi)地育齡夫婦不孕不育癥發(fā)病呈上升趨勢。美國流行病學(xué)調(diào)查顯示，育齡夫婦不孕不育患病率約為10-12％，發(fā)展中國家育齡期夫婦中約達10-15％，其中男性因素造成的不育占30％。這不僅嚴重困擾育齡夫婦及其家庭的和諧生活，也給國家和社會帶來沉重的負擔(dān)。但是，不孕不育的發(fā)生病因復(fù)雜，其發(fā)病機理目前尚不明確。因此，深入研究不孕不育的發(fā)生、發(fā)展機制，探索預(yù)防和治療不孕不育的新途徑，不僅具有重要的科學(xué)價值，而且具有潛在的臨床應(yīng)用前景和社會效益

2、。
　　 本課題組實驗發(fā)現(xiàn)βB2-晶體蛋白(Crybb2)基因敲除(Knock out，KO或Crybb2-/-)的雄性小鼠生殖能力明顯下降，其影響后果遠遠超出了一種非生殖功能相關(guān)基因被敲除后的結(jié)果，推測βB2-晶體蛋白有可能是一種重要的、尚未被報道的生殖功能相關(guān)的調(diào)控基因。由此引出的問題是：該蛋白通過何種機制對雄性小鼠的生殖功能起到調(diào)控作用?主要的影響因素有哪些?促進βB2-晶體蛋白體內(nèi)表達能否有助于改善生殖功能等，即為本課題

3、的研究目的。
　　 晶體蛋白是哺乳動物晶狀體細胞質(zhì)中主要的結(jié)構(gòu)蛋白，根據(jù)其在電場中的遷移能力要分為α、β、γ三大類。目前對于α晶體蛋白的特性及生物學(xué)作用機理已有較深入的研究，其中最重要一點是α晶體蛋白可以通過與錯誤折疊或變性的蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)揮分子伴娘功能，從而阻止其非特異性聚集，維持晶狀體的透明性；然而對β族晶體蛋白的生物學(xué)特性及其功能還所知較少，在β族晶體蛋白中，βB2-晶體蛋白含量最高，而且它的水溶性成分呈反常年齡依賴性增高，

4、其正常結(jié)構(gòu)及其水溶性成分水平對維持晶狀體的高折射系數(shù)和透明至關(guān)重要。
　　 前期研究表明，βB2-晶體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能均極為特殊，除了高表達于晶狀體內(nèi)、對維持晶狀體的透明等正常生物學(xué)特性至關(guān)重要外，在晶狀體外的多個組織器官如睪丸、腦、視網(wǎng)膜等也存在較高水平的表達，并發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。新近研究表明，βB2-晶體蛋白基因突變小鼠的生殖功能發(fā)生顯著下降，然而具體機制不明。本課題組在前期研究βB2-晶體蛋白在晶狀體混濁發(fā)生發(fā)展中的

5、作用及功能時，成功構(gòu)建了βB2-晶體蛋白基因敲除小鼠模型，在研究及飼養(yǎng)小鼠過程中發(fā)現(xiàn)，對比正常野生型(Wild type，WT)小鼠，該基因敲除的雄性小鼠生殖功能明顯下降。為探討其原因，本課題擬在前期研究基礎(chǔ)上，進一步觀察并研究βB2-晶體蛋白基因敲除后對雄性小鼠生殖功能的影響，深入探討βB2-晶體蛋白調(diào)控雄性生殖的作用機制，以期對臨床探究不育癥的發(fā)病機理提供新的思路和途徑。
　　 研究目的：
　　 觀察βB2-晶體蛋白

6、基因敲除后雄性小鼠生殖功能的改變，分析βB2-晶體蛋白在維持雄性小鼠正常生殖功能方面的作用，重點探討βB2-晶體蛋白調(diào)控雄性小鼠生殖功能的機制所在，以期對臨床不育病人發(fā)病機理的研究提供新的思路和實驗數(shù)據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.βB2-晶體蛋白基因敲除小鼠模型的建立及鑒定
　　 實驗前，剪取鼠尾末端組織，抽提基因組DNA，通過PCR擴增技術(shù)及瓊脂糖凝膠電泳分析方法對實驗小鼠的基因型進行鑒定。取小鼠眼晶狀體進

7、行勻漿離心后取上清液，通過Western blot技術(shù)對晶體蛋白的表達進行鑒定。
　　 2.明確βB2-晶體蛋白在小鼠睪丸組織內(nèi)的表達
　　 分別采用Realtime PCR和Western blot方法驗證βB2-晶體蛋白在正常野生型小鼠的睪丸內(nèi)存在表達，而在基因敲除小鼠的睪丸內(nèi)不存在表達；進一步采用免疫熒光組織化學(xué)染色方法明確βB2-晶體蛋白在正常小鼠睪丸組織內(nèi)的定位。
　　 3.觀察βB2-晶體蛋白基因敲除

8、對雄性小鼠生殖功能的影響
　　 分別將性成熟(8周齡)的正常野生型雌性小鼠與正常野生型雄性小鼠、基因敲除型雄性小鼠配對，各5對并分籠飼養(yǎng)，觀察一段時間內(nèi)兩者生產(chǎn)窩數(shù)及每窩產(chǎn)仔數(shù)等的差別；計數(shù)基因敲除小鼠的精子數(shù)目及精子活性；連續(xù)觀察雄性小鼠出生后數(shù)周內(nèi)睪丸組織發(fā)育情況，同時病理HE染色分析睪丸組織病理學(xué)的改變。
　　 4.睪丸組織生殖細胞增殖和凋亡檢測
　　 分別采用BrdU增殖檢測、TUNEL原位凋亡及流式細胞

9、術(shù)檢測凋亡等的方法，檢測βB2-晶體蛋白基因敲除后小鼠睪丸組織內(nèi)生殖細胞增殖、凋亡等的改變，分析精子計數(shù)減少的可能原因。
　　 5.生殖及凋亡相關(guān)蛋白的檢測
　　 采用Realtime PCR和Western blot方法檢測CaMKIV、Crem、Tsg23、Cklfsf2b、Bax以及Bcl-2等與生殖和增殖、凋亡等相關(guān)的基因及其蛋白在KO小鼠睪丸組織內(nèi)表達量的改變。
　　 6.小鼠血清睪酮含量檢測
　

10、　 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)分別檢測正常野生型及βB2-晶體蛋白基因敲除型小鼠血清睪酮含量，分析是否由于睪酮含量的改變引起雄性小鼠精子計數(shù)等生殖功能的改變。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1.實驗小鼠基因型及蛋白鑒定結(jié)果
　　 經(jīng)PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳分析，成功檢測了實驗小鼠的兩種基因型，純合的KO小鼠和純合的WT小鼠。經(jīng)Western blot鑒定，純合小鼠晶體蛋白未檢測到βB2-晶體蛋白的表達，野生型小鼠

11、晶體蛋白在分子量23KD處檢測到該蛋白的表達。
　　 2.βB2-晶體蛋白在睪丸組織中的表達
　　 Realtime PCR及Western blot方法分別檢測到βB2-晶體蛋白基因及其蛋白在野生型小鼠睪丸組織內(nèi)的表達，而在KO小鼠睪丸內(nèi)檢測不到βB2-晶體蛋白的表達；免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果進一步顯示βB2-晶體蛋白主要定位于小鼠睪丸組織的精原細胞內(nèi)。
　　 3.βB2-晶體蛋白基因敲除對雄性小鼠生殖功能的影

12、響
　　 相同生產(chǎn)周期內(nèi)，相對正常野生型配對小鼠，與KO雄鼠配對的雌性小鼠生產(chǎn)窩數(shù)及每窩的生仔數(shù)均明顯減少，性成熟的KO雄性小鼠精子計數(shù)減少，KO小鼠4周齡時睪丸組織明顯增生，而睪丸生精小管變細、并且稀疏。
　　 4.睪丸生殖細胞增殖、凋亡均顯著增加
　　 BrdU增殖和TUNEL原位凋亡及流式細胞凋亡檢測結(jié)果顯示，相對正常小鼠，基因敲除小鼠的睪丸組織內(nèi)精原細胞的增殖和凋亡顯著增加。
　　 5.小鼠睪丸組

13、織內(nèi)相關(guān)蛋白表達量的改變
　　 采用Realtime PCR和Western blot方法檢測了小鼠睪丸內(nèi)CaMKIV、Crem、Tsg23、Cklfsf2b、Bax和Bcl-2等生精和增殖、凋亡等相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果顯示KO小鼠睪丸內(nèi)CaMKIV和Bcl-2的mRNA及蛋白水平均顯著降低；Bax的蛋白表達量增加，mRNA表達呈現(xiàn)增多趨勢，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義；Crem、Tsg23及Cklfsf2b等表達量未見明顯改變。
　

14、　 6.KO小鼠血清睪酮含量降低
　　 ELISA方法檢測結(jié)果顯示，相對正常野生型小鼠，基因敲除小鼠的血清睪酮含量明顯降低。
　　 實驗結(jié)論：
　　 1.βB2-晶體蛋白在晶狀體外組織-睪丸內(nèi)也存在較高水平的表達。
　　 2.βB2-晶體蛋白基因敲除后雄性小鼠生殖功能顯著下降。
　　 3.βB2-晶體蛋白基因敲除后，小鼠睪丸內(nèi)CaMKIV表達量顯著降低，進而導(dǎo)致其下游蛋白Bcl-2表達減少，引起