鹿瓜多肽對脊髓損傷修復(fù)的作用研究.pdf

1、脊髓損傷（SpinalCordInjury,SCI）后出現(xiàn)代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、局部缺血、神經(jīng)元死亡等一系列繼發(fā)性損傷，加上中樞神經(jīng)自身再生能力有限，這些都成為脊髓損傷治療中難以克服的障礙。盡管脊髓的原發(fā)性損傷是不可逆轉(zhuǎn)的，但繼發(fā)性損傷卻是一個動態(tài)調(diào)控、可被逆轉(zhuǎn)的過程，因此也為人們提供了有效時機(jī)來挽救受損神經(jīng)元，最大程度減輕SCI帶來的災(zāi)難性后果。發(fā)展神經(jīng)保護(hù)劑，通過藥物對繼發(fā)性損傷的不同病理過程進(jìn)行干預(yù)，盡可能保護(hù)受損的神經(jīng)元以及促進(jìn)受

2、損神經(jīng)元的再生是目前脊髓損傷治療的主要方向之一，選擇安全有效的治療藥物對SCI的預(yù)后起著至關(guān)重要的作用。
　　鹿瓜多肽（Cervusandcucumispolypeptide,CCP）是由梅花鹿的骨骼和干燥的甜瓜籽制成的一種中藥復(fù)合制劑，在臨床上被廣泛應(yīng)用于骨折、骨質(zhì)疏松、疼痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療，療效顯著，無明顯不良反應(yīng)。其成分中包含著TGF-β，BMP，F(xiàn)GF等活性因子，它們參與了細(xì)胞的分化，緩解炎癥反應(yīng)，改善微循環(huán)以

3、及刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和促進(jìn)新生血管形成等諸多環(huán)節(jié)。脊髓損傷后出現(xiàn)的多種病理過程都能與鹿瓜多肽的治療靶點相匹配。因此我們設(shè)想：CCP是否可以用于脊髓損傷的治療以及該藥物的主要作用對象和影響的主要病理過程有哪些？為此我們設(shè)計了以下實驗：
　　實驗一：鹿瓜多肽對大鼠脊髓損傷后運動功能恢復(fù)的作用
　　曠場實驗：所有大鼠脊髓損傷模型采用中度脊髓夾傷模型。CCP治療后4d，BBB平均分值為12.6±0.86，明顯高于對照組（9.5±0

4、.83）（p<0.01）；此時大鼠已經(jīng)能夠持續(xù)負(fù)重行走，并伴有偶發(fā)的前后肢協(xié)調(diào)運動。SCI后7d，CCP治療組大鼠后肢運動恢復(fù)的速度（16.7±0.87）顯著高于對照組（13.7±0.56）（p<0.05），動物表現(xiàn)為持續(xù)的前后肢協(xié)調(diào)運動。但在SCI后14d，動物后肢運動恢復(fù)的程度在CCP處理組（18.0±0.56）和對照組(16.3±1.02)已無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）。
　　足跡實驗：脊髓損傷后5d，對照組大鼠后肢T

5、oedragging高達(dá)34.6％，與CCP治療組（9.6％）相比，具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.001)。至7d時，CCP組Toedragging為5％，與對照組（10％）已無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）。SCI后7d，對照組和CCP組大鼠均開始負(fù)重步行。對照組大鼠步長11.64±0.39cm，步寬4.69±0.21cm，CCP可增加大鼠步長12.98±0.22cm，具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.001），但步寬（4.22±0.20cm

6、）和對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）。CCP治療后7d的TS1-5為1.632±0.011mm，TS2-4為0.816±0.065mm，與生理鹽水對照組相比（TS1-5為1.744±0.064mm，TS2-4為1.092±0.091mm），可明顯減少1-5和2-4趾間的距離，具有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。
　　這部分實驗顯示：鹿瓜多肽在大鼠脊髓中度夾傷后可以促進(jìn)早期運動功能的恢復(fù)。
　　實驗二:鹿瓜多肽促進(jìn)脊髓損傷后

7、神經(jīng)元的存活
　　存活神經(jīng)元：根據(jù)GFAP標(biāo)記的損傷區(qū)域，以損傷區(qū)域為中心，分別向吻、尾兩側(cè)各連續(xù)取2個連續(xù)的1mm區(qū)域作為評估存活神經(jīng)元區(qū)域，從吻側(cè)向尾側(cè)方向分別標(biāo)記為R2、R1、C1、C2區(qū)。我們首先評估了脊髓夾傷后7d時R1和C1區(qū)內(nèi)總的NeuN陽性神經(jīng)元數(shù)目。對照組為1316±120個，CCP處理組為1824±130個，兩組之間存在顯著性差異（p<0.05）。脊髓夾傷后14d，對照組為1015±244個，CCP組為1699

8、±177個，兩組之間存在顯著性差異（p<0.05）。此外又分別比較了對照組和CCP組R2,R1,C1和C2四個區(qū)域在7d時間點的神經(jīng)元數(shù)目，僅在R1區(qū)兩組之間存在顯著性差異（614±103vs928±56,p<0.05）。脊髓損傷后14d，也僅在R1區(qū)兩組之間存在顯著性差異（555±121vs885±76,p<0.05）。上述實驗說明：CCP可以促進(jìn)鄰近脊髓損傷區(qū)的神經(jīng)元存活。提示：促進(jìn)神經(jīng)元存活可能是CCP有利于脊髓損傷功能恢復(fù)的原因

9、之一。
　　實驗三：鹿瓜多肽促進(jìn)脊髓損傷后的血管再生
　　RECA+血管面積：同實驗一對神經(jīng)元計數(shù)的劃分區(qū)域，分別計數(shù)了R2、R1、C1和C2區(qū)內(nèi)RECA+血管面積。脊髓夾傷后7d，生理鹽水對照組在R2,R1,C1,C2四個區(qū)域的RECA+面積（mm2）分別為0.076±0.006,0.074±0.003,0.065±0.002和0.059±0.009，給予CCP處理后，各區(qū)域面積分別為0.139±0.007,0.133±0

10、.010,0.143±0.010和0.099±0.008。CCP治療組4個區(qū)域的RECA+面積與對照相比均有顯著增加，具有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。SCI后14d，CCP可以增加R1區(qū)（0.184±0.015）和C1區(qū)（0.156±0.008）RECA+面積，與生理鹽水組相應(yīng)區(qū)域R1（0.121±0.015）和C1（0.105±0.015）相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05），但對R2和C2區(qū)RECA+血管面積無影響。R1區(qū)內(nèi)7d和14

11、d時存活神經(jīng)元的數(shù)量與RECA+血管面積呈良好的線性正性相關(guān)。
　　VEGFmRNA水平在脊髓損傷后7d和14d出現(xiàn)一定程度下降。7d時夾傷組VEGF的相對表達(dá)量為0.00517±0.00056，給予CCP后VEGFmRNA水平明顯增加，其相對表達(dá)量達(dá)0.00759±0.00065，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。至14d時，對照組VEGFmRNA水平仍保持在較低水平（0.00647±0.00021），CCP組VEGF

12、mRNA水平（0.00883±0.00065）仍顯著高于對照組，兩組之間存在統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。CD31mRNA水平較假手術(shù)組正常大鼠（0.00341±0.00072）升高，7d和14d時的相對表達(dá)量分別為0.00484±0.0006和0.00492±0.00093。給予CCP治療后，CD31mRNA表達(dá)明顯增加，7d和14d的相對表達(dá)水平為0.00759±0.00072和0.00835±0.00066，與對應(yīng)時間點生理鹽水對照

13、組和假手術(shù)組相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。假手術(shù)組VEGF受體Flk-1mRNA相對表達(dá)量為0.00134±0.00060。脊髓夾傷后7d和14d時的相對表達(dá)量分別為0.00211±0.00032和0.00162±0.00018，給予CCP后可明顯增加FLK-1mRNA的表達(dá)水平，對應(yīng)7d和14d的相對表達(dá)量分別為0.00430±0.00063和0.00308±0.00028，具有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。VEGF另一受體Fl

14、t-1mRNA表達(dá)水平在假手術(shù)組為0.00319±0.00124，脊髓損傷后7d和14d時的mRNA相對表達(dá)量與對應(yīng)CCP治療組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（0.00523±0.00098vs0.00557±0.00137,0.00553±0.00065vs0.00519±0.00085,p>0.05）。
　　該部分實驗證明CCP可以促進(jìn)損傷旁區(qū)血管發(fā)生，增加的RECA+血管面積與存活神經(jīng)元之間具有高度的正性線性關(guān)系。CCP可以增加VEGF、

15、CD31以及VEGF受體Flk-1mRNA表達(dá)水平，即CCP可能通過VEGF-VEGFR-2途徑發(fā)揮受損脊髓損傷旁區(qū)的促血管生成作用。
　　實驗四鹿瓜多肽促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生
　　GFAP染色：脊髓夾傷后4、7和14d，生理鹽水對照組的損傷區(qū)面積分別為2.06±0.27,1.60±0.15和1.16±0.28mm2。CCP可明顯減少4d時的損傷區(qū)面積到1.23±0.15mm2，7d時的損傷區(qū)面積到1.1±0.15mm2（p<

16、0.05）。SCI后14d，CCP處理組的損傷面積（0.93±0.22mm2）與對照組已無明顯差異（p>0.05）。與此同時，也降低了相應(yīng)4d和7d時GFAP的蛋白表達(dá)水平（p<0.05），14d時對照組和CCP組的GFAP水平無差異（p>0.05）。
　　體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖實驗：MTT顯示：CCP可以有效促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力和增殖；同樣流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)：CCP可以顯著提高處于S期和G2/M期星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例。以上結(jié)果

17、均提示CCP可以促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞體外劃傷的連續(xù)72小時觀察實驗顯示：CCP可以顯著促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移，減小劃傷面積。提示：CCP在脊髓損傷的早期階段活化星形膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)GFAP的表達(dá)，加速細(xì)胞遷移，縮小損傷區(qū)面積，促進(jìn)傷口愈合。
　　小結(jié)：通過以上的研究，CCP可以通過VEGF，CD31和VEGFR2（Flk-1）表達(dá)的升高促進(jìn)血管發(fā)生，挽救損傷周邊區(qū)神經(jīng)元，促進(jìn)運動功能的恢復(fù)。除此之外，CCP