基于磁性微球限進功能化的新型生物樣品預處理技術.pdf

1、隨著生物醫(yī)藥分析領域的不斷發(fā)展，生物樣品的預處理過程對建立一個可靠準確的藥物分析方法至關重要。傳統(tǒng)方法包括液液萃取和固相萃取法。近年來，磁性固相萃取以快速簡便且易于實現自動化高通量操作的優(yōu)勢而得到快速發(fā)展。然而，生物樣品中存在的大量內源性蛋白在磁性粒子表面發(fā)生的不可逆非特異性吸附作用，不僅會使磁性吸附劑對分析物的吸附能力降低，同時也容易使磁性粒子發(fā)生團聚而無法反復使用。
　　 為了消除生物樣品基質中大分子蛋白質的干擾，近年來發(fā)展

2、起來的限進性固相萃取在線聯用技術具有一定優(yōu)勢，其主要特點在于吸附材料的外表面具有親水性屏障，結合孔徑排阻效應，消除了蛋白在表面吸附和孔道堵塞等問題，而孔內修飾的疏水或離子交換基團可直接從生物樣品中富集目標物質，因此是一種被廣泛應用于復雜生物樣品及環(huán)境分析的生物樣品預處理技術。然而其在線固相萃取的應用模式從富集到分析通常只能完成單個樣品的操作，從而會導致機時利用率低，不能滿足生物樣品處理的高通量化要求。
　　 本論文著眼于滿足當前

3、高通量化的生物樣品預處理需求和解決傳統(tǒng)磁性固相吸附劑表面蛋白吸附的問題，將限進性概念結合到磁性分離技術中來，提出了基于限進性磁性固相萃取材料的制備策略。為此，本論文開發(fā)了基于不同磁性基質、內表面多樣化的一系列磁性限進材料。具體研究成果如下所述：
　　 1.采用多孔γ-Fe2O3@SiO2磁性硅膠作為基質，經過二醇基表面鍵合、十八烷基轉化以及脂肪酶選擇性水解等步驟，制備了內表面疏水而外表面親水的新型限進磁性材料。以牛血清白蛋白和甲

4、氨蝶呤及其結構類似物亞葉酸鈣、葉酸作為模型化合物證明了其外表面的親水基團及適宜的孔徑對大分子蛋白的排阻能力以及內表面的疏水基團對小分子物質的萃取能力。以其作為磁性限進固相吸附劑，對人血清基質中三種小分子治療藥物的萃取條件進行了優(yōu)化，并結合反相-高效液相色譜建立了分析方法，其良好的特異性、線性以及重復性均體現出了新型磁性限進萃取材料的優(yōu)越性和穩(wěn)定性，為臨床治療藥物監(jiān)測及生物樣品高通量自動化快速檢測提供了潛在的應用前景。
　　 2.

5、由于1中的材料與三種治療藥物的結合能力較弱，因此本章將1中的多孔磁性硅膠先進行環(huán)氧基修飾，然后采用粒徑約為50μm聚合物酸將外表面的環(huán)氧基先開環(huán)形成二醇基，然后再以十八胺、亞硫酸氫鈉及三乙胺鹽酸鹽分別與內表面殘余的環(huán)氧基進行反應，最終可以得到內表面依次為十八烷基、磺酸基和季銨鹽基而外表面為二醇基的新型磁性限進材料，避免了上一章節(jié)采取的脂肪酶水解法只能制備內表面為烷基基團的單一化類型。我們仍選擇1中的四種物質作為模型，并通過Langmui

6、r吸附等溫曲線，比較了三種磁性限進吸附劑對它們的飽和吸附容量，其結果表明，外表面的二醇基可以起到排阻蛋白的作用，而且內表面為磺酸基和季銨鹽基的磁性限進材料對小分子物質的吸附量要遠遠高于內表面為十八烷基的材料，說明甲氨蝶呤及兩種結構類似物更適合采用陰離子或陽離子交換模式來萃取，同時也證明了聚合物酸開環(huán)法比脂肪酶水解法在內表面多樣化修飾方面的可行性和優(yōu)勢。
　　 3.由于1和2中材料的孔徑還不能滿足對生物樣品中具有功能性但分子量較大

7、的多肽及蛋白質富集的要求，因此我們在上述6nm孔徑的磁性硅膠基礎上，利用浸鹽法對其進行擴孔處理，并通過形貌、晶型、磁性、比表而積變化來表征和篩選，最終確定300℃和400℃兩個溫度為最佳的擴孔條件。同樣采用聚合物酸開環(huán)法制備了內表面為十八烷基外表面為二醇基的擴孔磁性限進材料，并通過對胸腺五肽、胰島素以及牛血清白蛋白三種不同分子量模型物質的吸附證明了擴孔后的材料明顯對后兩者的吸附量增大，表明此法可以在不破壞磁性基質性質的基礎上對不同分子量

8、大小的生物分子具有不同程度的限進效果，使其在提取和富集復雜生物樣品中分子量不同的功能性目標物時具有更高的選擇性。
　　 4.為了進一步開發(fā)新方法來制備磁性限進材料，本章首先以模板法制備的多孔γ-Fe2O3作為磁核，再以十六烷基三甲基溴化銨為結構導向劑，利用sol-gel原理，采用層層包覆的方法將環(huán)氧基硅烷試劑作為外層親水性二醇基的功能前體，以氨基、巰基、苯基以及羧基硅烷試劑作為修飾內層的功能單體，制備得到外表面為二醇基而內表面分

9、別為氨基、磺酸基、苯磺酸基和羧基的核殼型磁性限進介質。我們以內表面為氨基的磁性限進介質作為模型材料，通過紅外光譜、高倍透射電鏡、熒光淬滅實驗、磁滯回線等手段證明了在制備過程中模板的有效去除、表面殼層和其孔道結構的形成、孔道所具備的限進性以及磁性能的變化。對于其它三種基于離子交換分配原理的核殼型磁性限進材料，我們進一步以牛血清白蛋白及硫酸特布他林、硫酸沙丁胺醇和鹽酸克倫特羅三種瘦肉精物質作為模型化合物，進行模型吸附實驗來評價三種材料的限進