鏈霉菌產生的(4S-R)-4,5-雙氫-4-羥基格爾德霉素及其他新次級代謝產物的發(fā)現(xiàn)與探索.pdf

1、鏈霉菌能夠產生結構豐富、活性多樣的次級代謝產物，是創(chuàng)新微生物藥物的重要來源，因此對鏈霉菌次級代謝產物進行挖掘和探索對于創(chuàng)新微生物藥物研究非常重要。
　　本論文共分為兩個部分，其中第一部分為基于細胞色素P450催化機制從Streptomyces hygroscopicus17997中發(fā)現(xiàn)和鑒定格爾德霉素新組分，第二部分為鏈霉菌CPCC203471和CPCC200466產生的抗生素新組分的發(fā)現(xiàn)和探索。
　　格爾德霉素(gelda

2、namycin，GDM)是由吸水鏈霉菌產生的苯醌型安莎類抗生素，為熱休克蛋白Hsp90的特異性抑制劑，它的抗腫瘤細胞活性(IC5o)在亞微摩爾級。但GDM的肝毒性強、水溶性差，只能作為抗腫瘤藥物開發(fā)的先導化合物。目前已報道數(shù)百個GDM的有機半合成衍生物，其中多種衍生物具有較好的體內活性，例如17-烯丙氨基-17-去甲氧基格爾德霉素（17-AAG）已針對多種腫瘤進入了Ⅱ期臨床試驗階段。此外，許多天然GDM類似物不斷從GDM產生菌中被發(fā)現(xiàn)和

3、分離出來，它們中某些化合物的水溶性和抗腫瘤細胞活性優(yōu)于GDM，預示著天然GDM類似物也有成為潛在的抗腫瘤藥物可能。
　　GDM的生物合成分為前格爾德霉素形成和PKS后修飾兩部分。在PKS后修飾過程中有一個從碳碳單鍵到雙鍵的氧化脫氫（去飽和）步驟，催化這步反應的酶GdmP屬于細胞色素P450超家族。細胞色素P450在生物體內主要催化羥基化反應，僅在極少數(shù)情況下催化去飽和反應，因此這步催化反應引起了我們的興趣:在催化去飽和反應時是否也

4、有羥基化產物出現(xiàn)？依據(jù)文獻對細胞色素P450催化機制的一般性分析總結，以及我們對GdmP初步的生物信息學分析結果，推測在GdmP催化的C-4,5位去飽和反應過程中也有可能出現(xiàn)羥基化產物。因此，發(fā)現(xiàn)該羥基化GDM類似物對于深入理解GDM生物合成具有重要作用，同時，對其抗腫瘤細胞活性進行測定對于獲得具有開發(fā)前景的GDM衍生物具有實際意義。
　　吸水鏈霉菌17997（Streptomyces hygroscopicus17997）是中國

5、醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所分離鑒定的一株GDM產生菌。根據(jù)上面的推測，我們通過TLC和LC-MS/MS等方法對吸水鏈霉菌17997的次級代謝產物進行了系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)了兩個預期的GDM新組分:化合物1和2。經分離純化后，采用HRESIMS、IR、NMR及Mosher法等確定化合物1和2為一對差向異構體，化學結構分別為(4S)-4，5-雙氫-4-羥基格爾德霉素(1)和(4R)-4，5-雙氫-4-羥基格爾德霉素(2)?；衔?和2不能生物轉

6、化為GDM，因此它們不是GDM生物合成中的正常中間產物，而是GdmP催化出現(xiàn)的支路產物?；衔?和2的發(fā)現(xiàn)使得我們對GdmP在GDM生物合成中催化C-4，5位氧化脫氫的機制有了更加深入的認識。
　　體外抗腫瘤細胞毒性測定表明:與GDM相比，(4S/R)-4，5-雙氫-4-羥基格爾德霉素的HepG2腫瘤細胞毒性降低約30倍。說明C-4位羥基化對GDM的活性有不利影響。
　　本論文第二部分對鏈霉菌CPCC203471和CPCC2

7、00466進行了抗菌活性產物鑒定及抗生素新組分發(fā)現(xiàn)探索。鏈霉菌CPCC203471和CPCC200466是經過對20余株不同來源的鏈霉菌進行次級代謝產物產生情況和活性情況初篩后選定的。這兩株菌次級代謝產物較為豐富且活性較好，值得進一步研究。
　　CPCC203471是從滇西森林土壤中分離得到的一株鏈霉菌，通過TLC、LC-MS以及HRMS等方法對其脂溶性次級代謝產物進行了分析，獲得其中的化合物的紫外-可見光吸收光譜、分子量和分子式

8、等信息后，檢索天然產物化合物庫及SciFinder數(shù)據(jù)庫并查閱文獻，對化合物進行排重，首先確定了CPCC203471產生的主要抗菌活性化合物為新生霉素(novobiocin)。隨后，從CPCC203471的脂溶性次級代謝產物中發(fā)現(xiàn)了6個新生霉素結構類似物，其分子量分別為555(b)、642(d，NOV-642)、555(e)、569(f)、569(g)、598(i)。根據(jù)分子量信息，推測化合物b為4"-O-去甲基-3"-O-去氨甲酰基新

9、生霉素（4"-O-desmethyl-3"-O-descarbamoylnovobiocin）;化合物f、g為同分異構體，其中一個可能為3"-O-去氨甲?；律顾?3"-O-descarbamoylnovobiocin)，另一個推測為天然的新生霉素新組分，由于產量較低留待后續(xù)研究;化合物i為4"-O-去甲基新生霉素(4"-O-desmethylno vobiocin);化合物d(NOV-642)為新生霉素新組分。經分離純化和NMR結構

10、解析，確定NOV-642為5-甲氧基新生霉素。
　　我們對NOV-642和新生霉素的抗菌活性(MIC)進行了測定和對比，發(fā)現(xiàn)NOV-642比新生霉素的活性約降低了3-7倍。結合文獻報道，5-羥基新生霉素比新生霉素活性降低約40倍，這給新生霉素類似物構效關系提供了新內容:新生霉素C-5位的取代會降低化合物活性，取代基團的極性越大活性降低越多。
　　已知新生霉素主要作用于革蘭氏陽性細菌，曾用于耐藥性金黃色葡萄球菌引起的感染，同時

11、新生霉素作為Hsp90 C-端抑制劑，還對多種癌細胞顯示抑制作用，并能與抗癌藥聯(lián)用、逆轉抗癌藥的耐藥性。因此，還需要對NOV-642進行更多的生物活性測定與評價，以確定其是否具有藥物開發(fā)潛力。
　　此外，從CPCC203471的次級代謝產物中我們還發(fā)現(xiàn)了大環(huán)內酰胺類化合物BE-14106(c)，文獻報道該化合物具有腫瘤細胞毒性。
　　CPCC200466是一株具有抗真菌活性的鏈霉菌。同樣通過TLC、LC-MS以及HRMS等方

12、法對該菌株的部分脂溶性次級代謝產物進行了分析鑒定，得到了化合物的紫外-可見光吸收光譜數(shù)據(jù)和分子量、分子式等信息，通過檢索SciFinder數(shù)據(jù)庫等并查閱文獻，對化合物進行排重，確定CPCC200466的主要次級代謝產物為噁唑霉素（oxazolomycin，OZM，化合物4），同時發(fā)現(xiàn)了與噁唑霉素分子量(655)相同的5個噁唑霉素小組分（化合物3、5、6、7、8），而目前文獻報道的分子量為655的噁唑霉素類化合物共3個，分別為噁唑霉素A(

13、4'Z，6'Z，8，E)、B(4'E，6'E，8'E)和C(4'Z，6'E，8，E)，三者互為幾何異構體。由此推斷，CPCC200466中含有至少3個噁唑霉素新組分有待確證。
　　噁唑霉素結構新穎，含有γ-內酰胺螺β-內酯環(huán)，噁唑環(huán)，(E，E)二烯和一個(Z，Z，E)三烯鏈，其中的γ-內酰胺-螺β-內酯環(huán)與處于臨床試驗階段的抗腫瘤藥物salinosporamide A（20S蛋白酶抑制劑）的藥效團相似。噁唑霉素具有抗菌、抗病毒和抗