從T輔助細胞的分化探討膽堿能抗炎通路對類風溫關節(jié)炎的保護作用機制.pdf

1、第一部分迷走神經及乙酰膽堿受體激動劑-煙堿對膠原誘導性關節(jié)炎小鼠T輔助細胞分布的影響
　　目的:T輔助細胞(helper T cell，Th cell)在調控類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)炎癥反應中起了非常關鍵的作用。膽堿能抗炎通路可抑制RA動物模型-膠原誘導性關節(jié)炎(collagen inducedarthritis，CIA)小鼠的關節(jié)炎癥。本部分探討迷走神經及乙酰膽堿受體激動劑-煙堿對CIA小鼠

2、體內T輔助細胞亞群分布的影響。
　　方法:40只DBA/1小鼠隨機分成4組:對照組:假手術+每天腹腔注射PBS一次;模型組:假手術+每天腹腔注射PBS一次+CIA模型復制;迷走神經切斷術組:迷走神經切斷術+每天腹腔注射PBS一次+CIA模型復制;煙堿處理組:假手術+每天腹腔注射煙堿一次+CIA模型復制。迷走神經切斷術組在關節(jié)炎復制前4天切斷小鼠左頸部迷走神經，假手術僅暴露并不切除左側頸部迷走神經。煙堿組在關節(jié)炎復制的前4天每天腹腔

3、注射煙堿(250μg/kg)。評估小鼠關節(jié)炎癥指數(shù)及關節(jié)組織病理炎癥程度。酶聯(lián)免疫吸附方法檢測小鼠外周血IFN-γ、IL-4和IL-17A水平。流式細胞術檢測小鼠脾臟中Th1、Th2及Th17細胞比例。Western-blot技術檢測小鼠脾臟中Th1、Th2及Th17細胞對應的專一性轉錄因子T-bet、GATA3及RORγτ的表達水平。免疫組化法檢測小鼠關節(jié)滑膜中RORγτ的表達情況。
　　結果:乙酰膽堿受體激動劑煙堿顯著減輕CI

4、A小鼠關節(jié)炎癥。迷走神經切斷組小鼠關節(jié)炎癥較CIA組加重，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義。與CIA組比較，煙堿組外周血IL-17A水平降低，IL-4水平增高;煙堿組脾臟中CD4+IL-17A+T細胞比例降低，CD4+IL-4+T細胞比例升高;煙堿組脾臟中Th17細胞專一性轉錄因子RORγτ表達下調，Th2細胞專一性轉錄因子GATA3表達上調;煙堿組關節(jié)滑膜中RORγτ表達降低;煙堿組和CIA組外周血IFN-γ、脾臟CD4+IFN-γ+T細胞比

5、例及T-bet表達差異無統(tǒng)計學意義。
　　結論:煙堿減輕CIA小鼠關節(jié)炎癥;煙堿減少CIA小鼠外周血、脾臟及關節(jié)滑膜Th17細胞分布;增加外周血及脾臟中Th2細胞分布，但對外周血及脾臟中Th1細胞分布無影響。
　　第二部分乙酰膽堿受體激動劑對RA患者Th17細胞分化的影響及MEK-ERK1/2通路在其中的作用
　　目的:Th17細胞亞群的分布異常及其細胞效應與RA炎癥發(fā)生發(fā)展密切相關，本部分探討乙酰膽堿受體激動劑煙堿和

6、GTS-21對RA患者Th17細胞分化的影響。
　　方法:分離RA患者外周血單個核細胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)，加入不同濃度煙堿及GTS-21培養(yǎng)，ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IL-17A水平;用磁珠分選法從RA患者外周血PBMCs中分離得到CD4+T細胞，在Th17極化培養(yǎng)體系中加入煙堿或GTS-21，或α7煙堿型乙酰膽堿(nicotinic acetylcholine，n

7、Ach)受體阻斷劑α銀環(huán)蛇毒預刺激后再加入煙堿或GTS-21處理，ELISA檢測培養(yǎng)上清中IL-17A水平，流式細胞術檢測Th17細胞比例，Western-blot法檢測RORc表達;CD4+T細胞經Th17分化培養(yǎng)72小時后，予煙堿，或MEK1/2抑制劑U0126預刺激后再加煙堿處理，ELISA檢測培養(yǎng)上清中IL-17A水平，Western-blot法檢測ERK1/2表達。
　　結果:不同濃度煙堿及GTS-21均可降低RA PB

8、MCs培養(yǎng)上清中IL-17A水平。煙堿及GTS-21可減少Th17細胞分化過程中CD3+CD8-IL-17A+T細胞比例，減少培養(yǎng)上清中IL-17A水平及胞內RORc的表達，而α銀環(huán)蛇毒可逆轉煙堿及GTS-21對Th17細胞分化的抑制作用。煙堿可促進Th17細胞內ERK1/2的磷酸化，而U0126可阻斷煙堿對ERK1/2的磷酸化。
　　結論:煙堿及GTS-21通過作用于α7nAch受體抑制RA患者CD4+T細胞向Th17細胞分化，

9、煙堿對Th17細胞分化的抑制作用與激活MEK1/2-ERK1/2信號通路有關。
　　第三部分乙酰膽堿受體激動劑對RA患者Th1、Th2細胞分化的影響
　　目的:在RA中，Th2細胞比例減少，Th1細胞比例增多，Th1/Th2比例失衡促進了RA關節(jié)炎癥的發(fā)生發(fā)展。本部分探討乙酰膽堿受體激動劑煙堿和GTS-21對RA患者Th1和Th2細胞分化的影響。
　　方法:分離RA患者外周血PBMCs，加入不同濃度煙堿及GTS-21培

10、養(yǎng)，ELISA檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4水平;用磁珠分選法從RA患者外周血PBMCs中分離得到CD4+T細胞，分別在Th1、Th2分化培養(yǎng)體系中加入煙堿或GTS-21，或乙酰膽堿受體阻斷劑α銀環(huán)蛇毒預刺激后再加入煙堿或GTS-21處理，ELISA檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4水平，流式細胞術檢測Th1和Th2細胞比例，Western-blot法檢測T-bet和GATA3表達。
　　結果:GTS-21可降低RA PBMC

11、s培養(yǎng)上清中IFN-γ水平。GTS-21可減少Th1細胞分化過程中CD3+CD8-IFN-γ+T細胞比例，減少培養(yǎng)上清中IFN-γ水平及胞內T-bet的表達，銀環(huán)蛇毒可逆轉GTS-21對Th1細胞分化的抑制作用。但煙堿對CD3+CD8-IFN-γ+T細胞比例、培養(yǎng)上清中IFN-γ水平及胞內T-bet表達無影響。煙堿和GTS-21可提高PBMCs培養(yǎng)上清中IL-4水平，煙堿及GTS-21可增加Th2細胞分化過程中CD3+CD8-IL-4+