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文檔簡介
1、背景:
骨缺損和骨不愈合是臨床常見病,如何修復骨缺損和促進骨愈合也是骨組織工程研究的重要內(nèi)容。支架、細胞和因子是骨組織工程研究的三大要素。近年來,有關骨生長因子的研究日益增多,BMP-2(Bone Morphogenetic Protein-2,骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2)是最重要的骨生長因子之一,其促進骨修復的功能已得到相關研究證實。BMP-2在體內(nèi)含量很少,基因重組表達技術則實現(xiàn)了rhBMP-2(Recombinant Human
2、 Bone Morphogenetic Protein-2,重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2)的批量生產(chǎn),使其臨床應用成為可能,但rhBMP-2的應用存在體內(nèi)半衰期短、降解快的問題,如果增加其使用量將又會帶來一系列的并發(fā)癥,使其臨床應用嚴重受限。微球緩釋技術是解決這個問題的方法之一,rhBMP-2與微球復合,不但能保護因子,還能延長其在體內(nèi)的作用時間,減少并發(fā)癥和治療費用。所以,本研究的目的是為rhBMP-2制備一種納米載體,使其更廣泛地應用于
3、骨科疾病的治療。
目的:
1.制備重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2-明膠納米微球(Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2-Gelatin nanoparticle,rhBMP-2-GN),檢測其理化特性和釋藥特點。
2.檢測rhBMP-2-GN對BMSCs(Bone marrow mesenchymal stem cells)的增值和分化效應。
3.為
4、rhBMP-2的臨床應用提供合適的納米載體,為下一步動物實驗提供必要的依據(jù)和更加可靠的解決方案。
方法:
1. rhBMP-2-GN的制備及檢測:(1)制備空白明膠納米微球。(2)掃描電鏡(Scanning Electron Microscope,SEM)觀察明膠納米微球的表面形態(tài),計算其平均粒徑,透射電鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)觀察明膠納米微球的內(nèi)部結構,粒度分析
5、儀檢測其吸水后的平均粒徑,計算其溶脹率。(3)將rhBMP-2和GN進行復合制備rhBMP-2-GN,利用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)測定加載的rhBMP-2量,計算其包封率和載藥量。(4)將rhBMP-2-GN分散到磷酸鹽緩沖液(PBS)中,檢測其累計釋藥的百分率。
2. rhBMP-2-GN對BMSCs的生物效應:(1)利用CCK-8法檢測rhBMP-2-
6、GN對BMSCs早期增殖效應的影響。(2)利用ALP染色法檢測rhBMP-2-GN對BMSCs早期分化效應的影響。(3)利用茜素紅-S鈣結節(jié)染色法檢測rhBMP-2-GN對BMSCs晚期分化效應的影響。
結果:
1.rhBMP-2-GN的制備:(1)“二次凝聚法”成功制備空白明膠納米微球。(2)明膠納米微球的物理特性:明膠納米微球表面光滑,球形規(guī)整,內(nèi)部多孔隙、通道,分散均一,干粉狀態(tài)平均粒徑為171.49 nm,吸
7、水膨脹后平均粒徑為313.01 nm,溶脹率為1.83。(3)成功制備rhBMP-2-GN,其包封率和載藥量分別是98.13±0.131%和58.89±0.079 ng/mg。(4)rhBMP-2-GN的體外釋藥時間在一個月以上。
2. rhBMP-2-GN對BMSCs的生物學作用:(1)rhBMP-2-GN組在第4天和第7天的細胞增值作用均明顯優(yōu)于對照組和明膠納米微球組(P<0.05)。(2)rhBMP-2-GN孔在第4天和
8、第7天的ALP染色均比對照孔和明膠納米微球孔的染色要深,差異較明顯。(3)rhBMP-2-GN孔在第28天出現(xiàn)鈣結節(jié)的數(shù)目能明顯多于對照孔和明膠納米微球孔。
結論:
1.“二次凝聚法”成功制備空白明膠納米微球,使rhBMP-2-GN具有較高的包封率和載藥量,體外緩釋效果良好。2. rhBMP-2-GN通過明膠納米微球的降解逐步釋放rhBMP-2,延長了rhBMP-2的作用時間,明顯促進了BMSCs的早期增殖和向成骨細
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