脫鈣骨基質(zhì)納米化條件及其復合重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白作為骨移植替代物的實驗研究.pdf

1、在現(xiàn)代高科技和高能量的戰(zhàn)爭中，傷員骨結(jié)構(gòu)的損傷往往較為嚴重，骨缺損發(fā)生率高，在后期的功能重建中，植骨術(shù)將發(fā)揮重要作用，單純依靠有限的自體骨在很多情況下難以滿足要求，植骨替代物的研制和臨床應用將為骨戰(zhàn)（創(chuàng)）傷的修復提供必要的物質(zhì)準備。
　　 臨床上對于各類脊柱傷病患者行手術(shù)治療后造成的脊柱不穩(wěn)，常需進行脊椎融合術(shù)，因而脊椎融合術(shù)是脊柱外科中最常施行的外科手術(shù)方式。據(jù)統(tǒng)計，在美國每年約要進行425，000例以上植骨融合術(shù)，其中60％

2、以上為脊柱融合術(shù)。相應的用于脊椎融合術(shù)的骨移植替代物和促進骨移植相關(guān)產(chǎn)品的醫(yī)療市場達4～20億美元。按此估算，我國每年實施的脊椎融合術(shù)數(shù)量應不亞于這一數(shù)字，其未來的骨移植材料市場需求極大。目前國內(nèi)外用于骨移植的材料絕大多數(shù)為自體松質(zhì)骨移植。雖然自體松質(zhì)骨，特別是自體髂骨被認為是骨移植材料的金標準，但其也存在明顯的缺點，如：來源有限，不能滿足大段骨缺損和各類翻修手術(shù)的需要，特別對于小兒患者；供區(qū)并發(fā)癥帶來的額外痛苦，有報道在5％～25％，

3、主要有：
　　 血管、神經(jīng)損傷，骨折，血腫，感染和慢性疼痛等；延長了手術(shù)時間，相應地增加了出血量。因此多年來，各國學者均致力于尋找合適的骨移植替代物以替代自體松質(zhì)骨，近10年來，骨移植和骨移植替代物的研究始終是脊柱外科領(lǐng)域中的熱點之一。隨著國民經(jīng)濟發(fā)展和人民生活水平提高，臨床上應用骨移植替代物取代自體骨進行植骨術(shù)已成必然趨勢，研制和開發(fā)適合我國國情的植骨替代物已迫在眉睫。
　　 近年來，納米技術(shù)已成為材料學領(lǐng)域引人注目的

4、研究熱點。全球?qū)τ诩{米材料、納米技術(shù)在生物醫(yī)學的應用有了廣泛的研究，但是少有應用到骨科領(lǐng)域。本課題通過納米脫鈣骨基質(zhì)復合重組人骨形成蛋白的制備及相關(guān)實驗，尋求一種良好的骨移植替代物。
　　 研究目的：
　　 1.制備人同種異體脫鈣骨基質(zhì)，為脫鈣骨基質(zhì)的納米化作準備。
　　 2.確定人同種異體脫鈣骨基質(zhì)的最佳納米化工藝3. 探索Nano-DBM/rhBMP-2 復合物的方法及復合物的塑形方法4. Nano-DBM/

5、rhBMP-2 復合物的相關(guān)檢測。
　　 5.家兔腰后路椎板間融合實驗，研究觀察植骨融合效果。
　　 材料和方法：
　　 1.將術(shù)中切取的人同種異體骨（除外腫瘤、感染及各類傳染性疾病），剔除骨膜和軟組織，將異體骨劈成骨條，刮除骨髓。用無菌凈化水反復沖洗，無水乙醇脫水2小時，乙醚脫脂1小時后通風干燥，置-80℃冰箱備用。脫鈣骨基質(zhì)的制備采用改良Urist 法，具體制備流程如下：1、無水乙醇浸泡2小時；2、去乙醇加乙

6、醚浸泡1小時；3、蒸餾水反復沖洗3次，去盡乙醚；4、0.6N 鹽酸浸泡72小時，浸泡過程中不斷攪拌，充分脫鈣，每12小時更換鹽酸溶液；5、蒸餾水沖洗3～5次后用蒸餾水浸泡過夜，充分去除骨塊內(nèi)的鹽酸；6、無水乙醇浸泡2小時；7、去除乙醇后乙醚浸泡1小時；8、通風處干燥后得到脫鈣骨基質(zhì)。通過急性毒性試驗、熱原實驗、溶血試驗、肌肉種植實驗檢測DBM的生物安全性。
　　 2.將DBM 顆粒放入液氮冷凍球磨粉碎機進行研磨，粉碎機轉(zhuǎn)速為80

7、0RPM，研磨半小時后取標本進行電鏡掃描觀察顆粒大小。最終取得微米級的DBM 顆粒。研磨過程中控制液氮注入速度，約8L/小時，使液面始終稍高于研磨球，避免溫度過高破壞DBM及其攜帶的蛋白因子。隨后根據(jù)預實驗結(jié)果，將液氮冷凍粉碎所得DBM 粉末按溶質(zhì)：溶劑比10％，置于MICROS 濕式超細研磨粉碎機內(nèi)進行粉碎。MICROS 初始研磨溫度為17 ℃，工作中最高溫度為25 ℃，研磨時由循環(huán)水進行冷卻降溫，研磨轉(zhuǎn)速選擇該機器最穩(wěn)定的速度，研磨

8、過程中取標本進行激光粒度儀分析，觀察顆粒直徑變化情況，待顆粒直徑不再繼續(xù)變小時停止研磨。研磨結(jié)束后將勻漿進行高速離心，取得納米DBM 標本，按比例將rhBMP-2均勻混合于納米DBM中，并將混合物標本置于模具內(nèi)塑形，置于-56 ℃真空低溫干燥箱進行干燥，取得Nano-DBM/rhBMP-2 復合物。對復合物進行表征檢測及生物安全性檢測。
　　 3.分組進行家兔腰椎后路椎板間植骨融合試驗，觀察融合情況。A組：
　　 Nan

9、o-DBM/rhBMP-2 復合物；B組：納米DBM 移植；C組：DBM 顆粒移植；D組：磷酸鈣顆粒移植。定期進行影像學檢測及取標本進行組織學檢查，觀察各組動物的腰椎融合狀況。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.確定液氮冷凍球磨粉碎及MICROS 超細研磨的DBM 納米化技術(shù)路線。
　　 第一步是將DBM 放入液氮冷凍球磨粉碎機進行研磨，取得微米級的DBM 顆粒。第二步將液氮冷凍粉碎所得DBM 粉末按合適的溶質(zhì)：溶劑置

10、于MICROS 濕式超細研磨粉碎機內(nèi)進行粉碎，取得納米DBM 顆粒。
　　 制得的納米DBM呈灰白色，質(zhì)地均勻、堅韌，有一定延展性，表面稍粗糙。電鏡掃描：放大1000～20000倍，可見DBM 顆粒直徑基本在50～100nm 左右，分布較均勻。
　　 2.成功進行了rhBMP-2 加載，并對加載后的納米DBM 進行塑形、干燥，獲得Nano-DBM/rhBMP-2 成品。研磨結(jié)束后將勻漿進行高速離心，取得納米DBM 標本，

11、將標本置于模具內(nèi)塑形，置于-56 ℃真空低溫干燥箱進行干燥。
　　 3.對Nano-DBM/rhBMP-2 復合物進行了X 線熒光分析及比表面孔測試，分析納米DBM的結(jié)構(gòu)及成份。
　　 4.對Nano-DBM/rhBMP-2的生物安全性進行了檢測。通過急性毒性實驗、熱原實驗、肌肉種植實驗、溶血實驗等，證實Nano-DBM/rhBMP-2 復合物符合醫(yī)療器械生物學評價的相關(guān)標準。
　　 5.通過家兔腰椎后路植骨融合