TCDD宮內(nèi)暴露對F1代雄鼠神經(jīng)行為發(fā)育和空間記憶學習能力的影響.pdf

1、目的：
　　以TCDD為代表的二噁英是典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，二噁英可透過胎盤屏障，由胎盤及乳汁進入胚胎及嬰兒體內(nèi)，引發(fā)宮內(nèi)及哺乳期二噁英暴露。世界衛(wèi)生組織2012年的文章指出，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物可對兒童早期發(fā)育產(chǎn)生不良影響，不僅包括引起隱睪、尿道下裂、青春期提前，還可影響兒童神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，對智力、行為和情感造成不良影響。健康與疾病的發(fā)育起源理論(Developmental Origins of Health and Disease

2、，DOHaD)指出，宮內(nèi)敏感時期及出生早期暴露于干擾，會改變器官功能與結(jié)構(gòu)編碼(重新編碼)，進而引發(fā)暴露個體以后生命過程中發(fā)生行為學習障礙。本實驗希望就宮內(nèi)暴露于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物TCDD對子代神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及記憶學習能力的影響進行探究，同時對造成這些影響的機制進行一定的探索。
　　內(nèi)容和方法：
　　本研究主要探討TCDD宮內(nèi)暴露對F1代雄鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)行為及空間記憶學習能力的影響，主要內(nèi)容總結(jié)如下。
　　1.TCD

3、D宮內(nèi)暴露實驗動物模型的建立：Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后合籠交配，陰栓出現(xiàn)即認為交配成功，并記為孕期第0天(GD0)。將孕鼠隨機分為兩個TCDD劑量組（劑量分別為200,800ng/kg bw）和溶劑對照組（玉米油+DMSO）。于孕期第8-14天(GD8-14)每日定時灌胃染毒。雄性子鼠出生后21天(PND21天)離乳分籠，并繼續(xù)飼養(yǎng)，直至雄鼠達到成年期(PND90)。
　　2.F1代雄鼠出生早期

4、神經(jīng)行為發(fā)育評價：F1代雄性仔鼠于PND5天接受早期神經(jīng)行為發(fā)育測試，同時觀察并記錄其開眼時間。早期神經(jīng)行為學測試包括：平面翻正實驗、懸崖回避實驗和負趨地性實驗。此外在PND10-PND15天期間，持續(xù)對雄鼠開眼情況進行觀察并記錄每只雄鼠的開眼時間，直至所有雄鼠均開眼為止。
　　3.成年F1代雄鼠Morris水迷宮實驗：F1代雄鼠繼續(xù)飼養(yǎng)至出生后90天(PND90)時，進行Morris水迷宮(Morris Water Maze)測

5、試，以評價宮內(nèi)TCDD暴露對子代雄鼠成年時空間記憶及學習能力的影響。根據(jù)Nature推薦的實驗流程，水迷宮實驗為期6天，1-5天為定位巡航實驗，第6天為空間探索實驗。定位巡航實驗中，受試大鼠每天接受4次訓練，記錄各實驗大鼠逃避潛伏期、累積路程、各象限停留耗時、各象限路程等指標。第6天記錄受試動物穿越原平臺次數(shù)、目標象限耗時及路程。同時試驗還對大鼠游泳策略進行評價分析。
　　4.F1代成年雄鼠血清激素水平檢測：本實驗采用直接化學發(fā)光

6、法測定雄性大鼠血清中睪酮和雌二醇的水平，采用 ADVIA-Centaur全自動化學發(fā)光免疫分析檢測儀（ADVIA-Centaur XP，Simens，Germany）及其配套試劑盒進行檢驗。雄性大鼠血清中甲狀腺激素五項的水平也使用該方法進行檢測，甲狀腺五項包括FT3、FT4、TSH、TT3和TT4。
　　5.F1代雄鼠海馬組織神經(jīng)系統(tǒng)免疫組化：將固定好的雄鼠海馬組織制作成石蠟切片，采用神經(jīng)元尼氏染色法，對海馬神經(jīng)元進行染色，并于光

7、鏡下計數(shù)海馬組織神經(jīng)元數(shù)量。采用膠質(zhì)細胞酸性蛋白免疫組化法對海馬星形膠質(zhì)細胞活性情況進行分析。
　　結(jié)果：
　　1.宮內(nèi)TCDD暴露造成F1代雄鼠早期神經(jīng)行為發(fā)育改變，800ng/kg bw劑量組雄鼠PND5表現(xiàn)出更高的活動力，同時開眼時間明顯提前。
　　2.宮內(nèi)TCDD暴露造成F1代雄鼠成年空間記憶與學習能力受損。Morris水迷宮中，兩個TCDD劑量組雄鼠表現(xiàn)均較對照組差，特別是800ng/kg bw組雄鼠在游泳速

8、度、逃離潛伏期、穿越原平臺次數(shù)上均不及對照組。這與800nk/kg bw劑量組雄鼠出生早期時活動力由于對照組形成有趣對比。但對各組大鼠游泳策略分析并沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。
　　3.宮內(nèi)TCDD暴露造成F1代雄鼠血清激素水平改變。研究發(fā)現(xiàn)，兩個劑量組雄鼠血清雌二醇水平均低于對照組，并且800nk/kg bw組與對照組的差別有統(tǒng)計學意義。甲狀腺激素水平?jīng)]有明顯變化。
　　4.宮內(nèi)TCDD暴露造成F1代雄鼠海馬神經(jīng)系統(tǒng)免疫組化染色改變

9、。研究發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)TCDD暴露并未對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量及形態(tài)造成顯著影響，但染毒后出現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞活性明顯下降現(xiàn)象。
　　結(jié)論：
　　通過以上實驗，我們發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)暴露于TCDD的F1代雄性大鼠神經(jīng)行為發(fā)育受到影響，表現(xiàn)為早期神經(jīng)行為發(fā)育提前，而成年后空間記憶與學習能力受到損傷。進一步研究發(fā)現(xiàn)，空間記憶與學習能力受損可能與海馬組織星形膠質(zhì)細胞受損相關(guān)。對成年 F1代雄鼠體內(nèi)性激素水平測定顯示，雌二醇水平下降，這提示海馬星形膠