孕期不同濃度十溴聯(lián)苯醚暴露對胎鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖分化與凋亡及子鼠學習記憶能力的影響.pdf

1、背景：
　　 1.多溴聯(lián)苯醚
　　 PBDEs是一系列含溴原子的芳香族化合物，根據(jù)苯環(huán)上溴原子的個數(shù)和位置不同，多溴聯(lián)苯醚總共有209種同分異構(gòu)體。其最大的用途是作為阻燃劑，在制造過程中被添加到復合材料中去，以提高產(chǎn)品的防火性。含有PBDEs的產(chǎn)品在生產(chǎn)、使用和廢棄過程中都可能釋放PBDEs到環(huán)境中，PBDEs在環(huán)境中難降解，滯留時間長，可形成持續(xù)性的有機污染物，并具有強親脂增水性、生物累積及生物放大效應(yīng)。大氣、水體、土

2、壤中的多溴聯(lián)苯醚可通過食物鏈對人類和高級生物的健康造成危害，也可通過“蚱蜢跳效應(yīng)”遠距離遷移，導致全球污染。
　　 2．十溴聯(lián)苯醚
　　 BDE-209是一種含十個溴原子的PBDEs，屬于高溴類化合物，由于其具有熱穩(wěn)定性好，添加量少，價格便宜等優(yōu)勢，是目前世界范圍內(nèi)生產(chǎn)及使用量最大的一種高溴類阻燃劑。也是我國主要生產(chǎn)和使用的阻燃劑，因此成為我國經(jīng)濟發(fā)達區(qū)域環(huán)境中的主要污染物。
　　 3．神經(jīng)干細胞NSCs發(fā)現(xiàn)最早

3、、最直接的證據(jù)是Stemple1992年從神經(jīng)嵴分離、鑒定出能產(chǎn)生神經(jīng)元和雪旺氏細胞的神經(jīng)嵴干細胞，這些細胞可以自我更新，產(chǎn)生同樣的具有多分化潛能的細胞。目前得到普遍認可的NSCs概念是由Mckay在1997年提出的：NSCs是指具有自我更新及增殖分化能力的細胞群，其多向分化潛能可分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞，并表現(xiàn)相應(yīng)的特化形態(tài)結(jié)構(gòu)、表型和生物學特征。
　　 本課題在前期實驗研究的基礎(chǔ)上，立足于母胎醫(yī)學領(lǐng)域，針對環(huán)

4、境污染中BDE-209對母嬰健康存在危害，研究母源性不同濃度的BDE-209暴露對胎鼠海馬NSCs增殖分化與凋亡及子鼠學習記憶能力的影響。
　　 第一部分：
　　 目的：
　　 取孕一天的SD大鼠每天進行胃灌不同濃度的BDE-209，連續(xù)胃灌十四天后常規(guī)飼養(yǎng)，產(chǎn)下的子鼠25日齡斷乳，通過Morris水迷宮法觀察子鼠的學習記憶能力。
　　 材料與方法：
　　 1.購SPF級孕一天的SD大鼠，隨機將孕

5、鼠分為空白對照組A、花生油組B、實驗組C、D、E，每組5只?？瞻讓φ战MA常規(guī)飼養(yǎng)，花生油組B予胃灌等量的精練花生油，實驗組C、D、E分別予10mg、30mg、50mg㎏/d的BDE-209溶于等量精練花生油中進行胃灌。自購買日開始每天上午避光經(jīng)口胃灌一次，直至孕14天。
　　 后繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)至分娩后25日斷乳，每組斷乳后隨機選取雄性子鼠各20只為為相應(yīng)的A、B、C、D、E組。
　　 2.Morris水迷宮法檢測子鼠學習記

6、憶能力。
　　 結(jié)果：
　　 Morris水迷宮法檢測孕期暴露不同濃度BDE-209的子鼠學習記憶能力示：各組潛伏期有隨時間變化的趨勢(F=71.686，P=0.000)，時間因素的作用隨著分組不同而不同(F=6.863，P=0.000)，分組因素起作用，在第4天的測試中，對照組A與花生油組B均數(shù)差別無統(tǒng)計學意義，實驗組D、E子鼠的逃避潛伏期較對照組A延長。
　　 結(jié)論：
　　 孕期暴露一定低濃度的BDE

7、-209可導致其子鼠學習記憶能力下降。說明低濃度的BDE-209也可產(chǎn)生神經(jīng)發(fā)育毒性效應(yīng)。
　　 第二部分：
　　 目的：
　　 取孕一天的SD大鼠每天進行胃灌不同濃度的BDE-209，孕十四天時無菌取其胎鼠海馬組織，進行體外無血清培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，觀察孕期不同濃度BDE-209的暴露對胎鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖的影響。
　　 材料與方法：
　　 1.購SPF級孕一天的SD大鼠，隨機將孕鼠分為空白對照組

8、A、花生油組B、實驗組C、D、E，每組5只?？瞻讓φ战MA常規(guī)飼養(yǎng)，花生油組B予胃灌等量的精練花生油，實驗組C、D、E分別予10mg、30mg、50mg㎏/d的BDE-209溶于等量精練花生油中進行胃灌。自購買日開始每天上午避光經(jīng)口胃灌一次，直至孕14天。
　　 2.取孕14天的胎鼠海馬組織，體外無血清培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，每天在倒置顯微鏡下進行細胞形態(tài)觀察。根據(jù)情況7-10天內(nèi)，以1:2的比例進行傳代培養(yǎng)。
　　 3.將培養(yǎng)7

9、天后的神經(jīng)球進行免疫細胞熒光法的神經(jīng)干細胞鑒定檢測，流式細胞術(shù)檢測神經(jīng)干細胞的純度。
　　 4.CCK-8法檢測培養(yǎng)2代的神經(jīng)干細胞增殖，每組設(shè)6個平行樣品。
　　 結(jié)果：
　　 1.原代培養(yǎng)的海馬組織細胞經(jīng)無血清培養(yǎng)，24h后可見神經(jīng)球形成，3-5天后神經(jīng)球逐漸從小到大、由不規(guī)則到邊緣整齊，單細胞較少。第7天觀察神經(jīng)球可增大至200μm，表面可見單細胞突出呈魚泡狀，折光性強。直徑超過200μm時，球中心的顏色開

10、始變黑，隨著神經(jīng)球的增大黑色逐漸加深加寬，折光性逐漸減弱。
　　 2.免疫細胞熒光染色，神經(jīng)干細胞的特異性分子巢蛋白呈陽性表達，DAPI染核發(fā)藍色熒光。
　　 3.流式細胞術(shù)所測得的神經(jīng)球中神經(jīng)干細胞的純度為98.02％。
　　 4.倒置顯微鏡觀察神經(jīng)干細胞形態(tài)，各實驗組可見神經(jīng)球形成的速度較對照組緩慢，神經(jīng)球胞體較小，邊緣不是很規(guī)則，周圍死細胞較多，并隨著孕期暴露BDE-209 濃度的增加，上述現(xiàn)象漸明顯。

11、r>　　 5.CCK-8法檢測神經(jīng)干細胞增殖：從各組細胞的A 值及生長曲線圖可見，各實驗組的細胞增殖總趨勢較對照組A下降，根據(jù)統(tǒng)計分析，對照組A 與花生油組B均數(shù)差別無統(tǒng)計學意義，其余各組兩兩之間均數(shù)比較差別均有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：
　　 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的胎鼠海馬組織神經(jīng)干細胞具有自我更新和增殖能力，孕期暴露BDE-209可導致胎鼠海馬神經(jīng)干細胞的增殖能力下降，且其增殖能力隨孕期BDE-209暴露濃度的增加而降

12、低。
　　 第三部分：
　　 目的：
　　 取孕一天的SD大鼠每天進行胃灌不同濃度的BDE-209，孕十四天時無菌取其胎鼠海馬組織，進行體外無血清培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，觀察孕期不同濃度BDE-209的暴露對胎鼠海馬神經(jīng)干細胞凋亡的影響。
　　 材料與方法：
　　 1.購SPF級孕一天的SD大鼠，隨機將孕鼠分為空白對照組A、花生油組B、實驗組C、D、E，每組5只?？瞻讓φ战MA 常規(guī)飼養(yǎng)，花生油組B予胃灌等

13、量的精練花生油，實驗組C、D、E分別予10mg、30mg、50mg㎏/d的BDE-209溶于等量精練花生油中進行胃灌。自購買日開始每天上午避光經(jīng)口胃灌一次，直至孕14天。
　　 2.取孕14天的胎鼠海馬組織，體外無血清培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，每天在倒置顯微鏡下進行細胞形態(tài)觀察。根據(jù)情況7-10天以1:2的比例進行傳代培養(yǎng)。
　　 3.采用流式細胞儀Annexin V-FITC法檢測培養(yǎng)2代的海馬神經(jīng)干細胞的凋亡，每組設(shè)6個平行樣

14、品。
　　 結(jié)果：
　　 流式細胞儀Annexin V-FITC法檢測孕期不同濃度BDE-209暴露后胎鼠海馬神經(jīng)干細胞的凋亡結(jié)果示：各實驗組的細胞凋亡率較對照組A增高，根據(jù)統(tǒng)計分析對照組A與花生油組B均數(shù)差別無統(tǒng)計學意義，其余各組間兩兩之間的均數(shù)比較差別均有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：
　　 孕期暴露BDE-209可導致胎鼠海馬神經(jīng)干細胞的凋亡率增高，且其凋亡率隨著孕期暴露BDE-209濃度的增加而增高。

15、
　　 第四部分：
　　 目的：
　　 取孕一天的SD大鼠每天進行胃灌不同濃度的BDE-209，孕十四天時無菌取其胎鼠海馬組織，進行體外無血清培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，觀察孕期不同濃度BDE-209的暴露對胎鼠海馬神經(jīng)干細胞分化的影響。
　　 材料與方法：
　　 1.購SPF級孕一天的SD大鼠，隨機將孕鼠分為空白對照組A、花生油組B、實驗組C、D、E7?？瞻讓φ战MA常規(guī)飼養(yǎng)，花生油組B予胃灌等量的精練花生油

16、，實驗組C、D、E分別予10mg、30mg、50mg㎏/d的BDE-209溶于等量精練花生油中進行胃灌。自購買日開始每天上午避光經(jīng)口胃灌一次，直至孕14天。
　　 2.取孕14天的胎鼠海馬組織，體外無血清培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，根據(jù)情況7-10天以1:2的比例進行傳代培養(yǎng)。
　　 3.將無血清培養(yǎng)2代的神經(jīng)球用10％胎牛血清誘導分化，每天在倒置顯微鏡下進行細胞形態(tài)觀察。
　　 4.用免疫細胞熒光法將誘導分化后第7天的神經(jīng)

17、干細胞進行分化檢測，每組設(shè)6個平行樣品。
　　 結(jié)果：
　　 1.倒置顯微鏡下見誘導分化的細胞大部分貼壁生長，24h后神經(jīng)球周圍出現(xiàn)很多有突起的細胞，并向外延伸，3d后神經(jīng)球周圍伸出的突起增多且呈輻射狀延長，7d后延長的細胞間突起相互交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)。
　　 2.經(jīng)免疫熒光染色見：NeuN 染色陽性細胞胞質(zhì)發(fā)綠色熒光，胞體三角形、圓形、或錐形等，細胞核較大呈圓形；GFAP染色陽性細胞胞質(zhì)發(fā)紅色熒光，胞體長梭形或多角形

18、，有較長的突起，細胞核較小呈橢圓形；DAPI 染色發(fā)藍色熒光。
　　 3.免疫熒光法檢測孕期不同濃度BDE-209暴露的胎鼠海馬NSCs 分化為神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的比例示：各實驗組NSCs分化為神經(jīng)元的比例均較對照組低，根據(jù)統(tǒng)計分析對照組A 與花生油組B 均數(shù)差別無統(tǒng)計學意義，其余各組兩兩之間均數(shù)比較差別均有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：
　　 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的胎鼠海馬組織神經(jīng)干細胞具有多向分化能力，經(jīng)誘導可分化為神