甲狀腺激素上調(diào)Bcl-2的表達減少慢性腦缺血大鼠海馬細胞凋亡.pdf

1、研究背景：
　　 當(dāng)今癡呆的發(fā)病率逐年上升，在65歲以上的個體中癡呆患病率可達5％-20％，癡呆的高發(fā)病率和高致殘率給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟和精神負擔(dān)，這已使其成為了21世紀(jì)最嚴重的社會問題之一。但無論是阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)還是血管性癡呆(vascular dementia，VD)，發(fā)病機制目前均不明確，故缺乏有效的預(yù)防和治療手段。因此，積極地探索和研究癡呆的病因和發(fā)病機制已成為防治癡呆的

2、當(dāng)務(wù)之急。
　　 近年的臨床觀察發(fā)現(xiàn)血管性癡呆患者存在血清甲狀腺激素(Thyroidhormones，THs)水平異常，而促甲狀腺激素可維持在正常水平，這種激素水平的變化符合正常甲狀腺功能病態(tài)綜合征(Euthyroid sick syndrome，ESS)的改變。正常甲狀腺功能病態(tài)綜合征是指由嚴重的甲狀腺外的全身性疾病、手術(shù)和禁食等原因?qū)е碌募谞钕俟δ軝z測異常，而甲狀腺本身并無病變的一組臨床綜合征。曾經(jīng)的觀點認為這是機體的一種適

3、應(yīng)性保護反應(yīng)，可減輕損傷后的應(yīng)激反應(yīng)程度，但現(xiàn)在越來越多的人傾向認為這是疾病預(yù)后不佳的一種表現(xiàn)。有人提出，正常甲狀腺功能病態(tài)綜合征的發(fā)生可能和下丘腦-垂體-甲狀腺(Hypothalamus-pituitary-thyroid axis，HPT)軸的功能紊亂有關(guān)，各種損傷因素作用于下丘腦，使之發(fā)生功能性或結(jié)構(gòu)性病變，甲狀腺激素的合成及代謝過程隨即受到影響，而減少的甲狀腺激素?zé)o法負反饋上調(diào)HPT軸的上游激素，因此產(chǎn)生一系列激素水平的異常及代

4、謝障礙。在一項對83例70歲以上受試者進行的臨床研究中，Ichibangase等人發(fā)現(xiàn)在含癡呆及未癡呆的所有受試者中，年齡與血清游離三碘甲腺原氨酸（3，5，3'-triiodothyronine，T3）濃度均呈負相關(guān);血管性癡呆患者的血清游離T3水平顯著低于未癡呆者。這些觀察提示，認知功能與血清游離T3水平密切相關(guān);在血管性癡呆的患者中，血清游離T3水平可以反映患者的健康及認知狀態(tài)。
　　 本課題組在前期研究中，應(yīng)用2VO方法制

5、備慢性腦缺血致血管性認知功能障礙（Vascular cognitive impairment，VCI）的動物模型，通過測定慢性腦缺血后腦組織甲狀腺激素的水平，發(fā)現(xiàn)在大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的同時，其腦組織甲狀腺素(thyroxine，T4)及三碘甲腺原氨酸的濃度均有所下降，而補充外源性甲狀腺激素的慢性腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善，提示血管性認知功能障礙可能與中樞甲狀腺激素代謝異常有關(guān)。但甲狀腺激素通過何種機制影響大鼠腦缺血后的認知功能尚

6、未見文獻報道。因此，有必要進一步明確甲狀腺激素在改善血管性認知功能障礙中的作用及機制，為血管性認知功能障礙的防治工作提供必要的理論支持，也為促進患者認知功能的恢復(fù)創(chuàng)造一種新的可能。
　　 近年來，人們對于血管性認知功能障礙的發(fā)病機制進行了比較深入的研究。De Jong等人發(fā)現(xiàn)即使在腦血流的恢復(fù)期（雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎后6個月至1年內(nèi)的任何時間點），大鼠仍存在空間學(xué)習(xí)記憶能力的損害，提示雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎后的記憶障礙不僅僅由腦低灌注本身

7、所引起，也與缺血誘發(fā)的永久性損害有關(guān)。Imai等人發(fā)現(xiàn)，在結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈后第3-7天即可觀察到人鼠海馬CA1區(qū)部分神經(jīng)元的死亡，術(shù)后第二周，出現(xiàn)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元受損的大鼠為6％-29％，而在術(shù)后第四周，該比例增加到55％，這證實了雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎后的慢性腦缺血會造成海馬區(qū)的神經(jīng)元損傷。眾多研究表明，慢性腦缺血可通過炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激引發(fā)海馬區(qū)神經(jīng)元的去極化、胞內(nèi)外離子失衡、細胞骨架及膜結(jié)構(gòu)改變、線粒體功能障礙及興奮性氨基酸毒性

8、等代謝功能異常，從而造成神經(jīng)細胞的凋亡，而缺血后的海馬細胞凋亡則是血管性認知功能障礙的重要致病環(huán)節(jié)。用神經(jīng)保護劑對抗缺血腦組織的氧化應(yīng)激或減輕胞內(nèi)鈣超載，可同時表現(xiàn)出海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的減少及空間學(xué)習(xí)記憶功能的改善，這進一步證明了慢性腦缺血會造成海馬區(qū)的細胞凋亡，而正是這種細胞凋亡導(dǎo)致了大鼠認知功能的下降。
　　 眾所周知，甲狀腺激素可以影響胚胎腦組織的細胞增殖、分化過程，樹突和軸突生長，神經(jīng)元遷移，髓鞘形成等，對哺乳動物中樞神經(jīng)

9、系統(tǒng)的發(fā)育成熟至關(guān)重要。然而，甲狀腺激素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用不僅局限于胚胎與年幼個體，在成年期甚至老年期同樣起著至關(guān)重要的作用，可以說，甲狀腺激素對于個體的影響是終生性的。它可以調(diào)控乙酰膽堿、多巴胺等多種神經(jīng)遞質(zhì)的作用，可以調(diào)控細胞因子的表達和酶蛋白的活性，可以通過調(diào)控線粒體的功能影響腦組織的能量代謝，也可以通過調(diào)節(jié)蛋白激酶等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)節(jié)顱內(nèi)血管的舒張。成年的甲狀腺功能減退癥可能造成患者精神行為等方面的異常，在老年患者則更可能造成

10、皮層萎縮導(dǎo)致癡呆，這些都強調(diào)了甲狀腺激素對于正常腦功能維持的重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，T3可減少缺血再灌注的心肌組織釋放乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)及表達caspase-3，提示其可減少缺血再灌注組織的損傷及細胞凋亡。分別于大腦中動脈阻斷1小時及再灌注6小時時予大鼠T4腹腔注射，可抑制缺血腦組織星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的活化，增加腦源性神經(jīng)生長因子及膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，降低環(huán)氧合酶-2（COX-

11、2）及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Induced nitric oxide synthase，iNOS)等炎癥相關(guān)氧化酶的活性，從而減少急性缺血再灌注后腦梗死灶的面積。在星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)基中加入T3，可使膠質(zhì)細胞本身免受高濃度谷氨酸的毒性反應(yīng)，同時也可增加與膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)的神經(jīng)元的存活率，提示其對培養(yǎng)的神經(jīng)元同樣具有保護作用。但甲狀腺激素對慢性腦缺血海馬的細胞是否具有保護作用尚無有力的文獻支持。若能設(shè)計實驗證明其可減少慢性腦缺血大鼠的海馬細胞

12、凋亡，將使我們對甲狀腺激素改善2VO大鼠認知功能的機制有所了解，并更進一步確證海馬細胞凋亡在血管性癡呆發(fā)病機制中的重要意義。
　　 有研究表明抗凋亡蛋白Bcl-2是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)程序性細胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素。有研究發(fā)現(xiàn)用丙基硫氧嘧啶(PTU)處理造成的大鼠甲狀腺激素減退癥（甲減）模型存在腦內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2的下調(diào)和促凋亡蛋白Bax的上調(diào)，同時腦組織內(nèi)細胞凋亡增多。甲狀腺激素干預(yù)可增加外傷腦組織的Bcl-2表達從而減少外傷后的

13、神經(jīng)元凋亡。這些都提示我們甲狀腺激素對缺血海馬細胞凋亡的調(diào)控可能通過對Bcl-2表達的調(diào)控實現(xiàn)。但甲狀腺激素對Bcl-2的表達及缺血海馬細胞凋亡的具體調(diào)控時間和方式尚無文獻報道。
　　 綜上所述，課題組前期研究證明:大鼠慢性腦缺血時腦組織T3及T4水平明顯低下，并且伴認知功能損害，而補充外源性甲狀腺激素可改善缺血損傷的認知功能。為了進一步闡明甲狀腺激素修復(fù)血管性認知功能障礙的作用及其機制，我們提出假說:甲狀腺激素通過減少缺血海馬

14、的細胞凋亡改善慢性腦缺血后受損的認知功能;甲狀腺激素的這種細胞保護作用是通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達實現(xiàn)的。為證實該假說，本課題擬采用成年大鼠雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎術(shù)制備慢性腦缺血致血管性認知障礙的動物模型，并且設(shè)置缺血后THs干預(yù)處理組，通過尼氏染色、免疫熒光標(biāo)記及免疫印記檢測(Westernblotting，WB)等方法，觀察不同組大鼠海馬的細胞凋亡以及甲狀腺激素是否通過調(diào)節(jié)Bcl-2的表達影響細胞凋亡，以期從細胞保護角度闡明

15、甲狀腺激素改善慢性腦缺血后受損認知功能的分子生物學(xué)機制，為促進血管性癡呆患者認知功能的恢復(fù)提供新的理論依據(jù)及治療靶點。
　　 研究方法：
　　 一.實驗分組:將50只成年SPF級雄性大鼠隨機分為慢性腦缺血組(n=16)，缺血后T3干預(yù)組(n=18)和假手術(shù)組(n=16)。慢性腦缺血組再隨機分為2VO7天組(n=8)和2VO14天組(n=8);同樣，缺血后T3干預(yù)組隨機分為T37天組(n=10)和T314天組(n=8);假

16、手術(shù)組隨機分為假手術(shù)7天組(n=8)和假手術(shù)14天組(n=8)。每亞組中各取5只大鼠用作切片染色，其余的用作免疫印記(Western Blotting，WB)檢測。
　　 二.尼氏染色:通過尼氏染色標(biāo)記神經(jīng)元，觀察術(shù)后14天海馬CA1區(qū)的組織結(jié)構(gòu)及細胞凋亡情況。
　　 三.免疫熒光染色:TUNEL染色分別標(biāo)記術(shù)后7天和14天海馬齒狀回的凋亡細胞，計算各時間點各組海馬齒狀回的細胞凋亡指數(shù)。
　　 四.免疫印跡檢測:

17、分別觀察術(shù)后7天和14天三組大鼠海馬區(qū)Bcl-2蛋白的表達情況。
　　 五.統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni法，P＜0.05定義為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果：
　　 一、術(shù)后14天，假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)整齊，錐體細胞排列致密，數(shù)量較多。與假手術(shù)組相比，缺血后的CA1區(qū)結(jié)構(gòu)明顯松散雜亂，細胞層崩解，

18、神經(jīng)元排列稀松且數(shù)量減少。T3組的海馬結(jié)構(gòu)雖與假手術(shù)組相比稍顯紊亂，但較2VO組的結(jié)構(gòu)完整性強，細胞數(shù)目則與假手術(shù)組基本一致。
　　 二、術(shù)后7天，三組齒狀回顆粒細胞的凋亡指數(shù)從高到低依次為2VO組、T3組及假手術(shù)組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.060)。假手術(shù)組術(shù)后14天的海馬齒狀回內(nèi)可見少量呈紫色的凋亡細胞;2VO組術(shù)后14天的海馬齒狀回內(nèi)可見大部分細胞發(fā)生凋亡;缺血后T3處理組術(shù)后14天的海馬齒狀回約一半的細胞發(fā)生凋亡。通

19、過細胞計數(shù)及計算可知，三組間的齒狀回細胞凋亡指數(shù)存在顯著性差異(P＜0.001)，其中2VO組大鼠海馬齒狀回細胞凋亡指數(shù)顯著高于假手術(shù)組(P＜0.001)，缺血后T3干預(yù)組的海馬齒狀回細胞凋亡指數(shù)明顯低于2VO組(P=0.001)。
　　 三、各組上樣蛋白中GAPDH表達量基本一致。術(shù)后7天時三組Bcl-2蛋白的表達量從高到低依次為T3組、2VO組及假手術(shù)組;術(shù)后14天，2VO組BcL-2蛋白的表達少于假手術(shù)組，T3組則多于假手