大鼠脊髓損傷后坐骨神經電興奮性以及損傷脊髓GAP-43及VEGF蛋白表達的變化.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)對個人來說是一件災難性的事件，可以引起患者脊髓損傷節(jié)段水平以下身體的感覺和運動功能的部分或全部喪失，而且還會給家庭和社會帶來一系列負面影響。近年來，大多數(shù)國家由于交通事故、暴力事件、意外情況等SCI的發(fā)病率居高不下，并有上升趨勢，然而對于SCI尚沒有特別有效的治療措施和方法。因此對SCI后脊髓神經元細胞的修復、再生及其功能恢復的進一步研究具有非常重要的醫(yī)療價值和社會意義。

2、 脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后對機體功能產生的影響和損害取決于脊髓原發(fā)性損傷與繼發(fā)性損傷的程度，以及損傷脊髓神經細胞自我修復和再生的能力。脊髓的原發(fā)性創(chuàng)傷迅速使細胞膜瓦解，破壞髓鞘、軸突及微管系統(tǒng)，從而釋放許多有害物質引發(fā)更為嚴重的繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷是由多種細胞和分子機制啟動的病理生理過程所導致的神經退行性變。這種神經退行性變不僅局限在損傷部位，還擴散到損傷周邊部位。由于原發(fā)性損傷的不可逆轉性，故目前醫(yī)

3、學研究和臨床治療修復損傷的方法主要是(1)針對脊髓創(chuàng)傷后繼發(fā)性損傷的細胞分子機制，如自由基生成、一氧化氮、血小板活化因子、興奮性氨基酸、離子紊亂、細胞炎性因子、脂質過氧化物及細胞凋亡等尋求防治措施； (2)應用神經生長因子、生長相關蛋白和血管內皮生長因子等，促進損傷脊髓神經細胞的修復和神經軸突再生。 早在1944年，Berry應用電生理方法研究了周圍神經再生，隨后在1948年Hodes將此方法應用于臨床，此后又發(fā)現(xiàn)刺激強度一時

4、間曲線、神經傳導速度與周圍神經損傷和再生的電生理變化規(guī)律。現(xiàn)在，電生理學方法已成為評價周圍神經損傷結構和功能修復的常用有效方法。 GAP-43(growth associated proteins-43，生長相關蛋白)是80年代初發(fā)現(xiàn)的與神經發(fā)育、軸突再生、突觸重建密切相關的一種快速轉運胞膜磷酸蛋白，被認為是神經元發(fā)育和再生的一個內在決定因子。GAP-43蛋白及其mRNA廣泛分布于大腦、小腦、脊髓、背根神經節(jié)以及自主神經系統(tǒng)的神

5、經元內，在發(fā)育中的神經元沿著整個軸突表達，在生長錐表達尤其豐富。研究發(fā)現(xiàn)GAP-43能夠通過促進肌動蛋白聚集，增強生長錐的活力，從而促進神經軸突的生長、分化、再生及突觸重建。還發(fā)現(xiàn)GAP-43蛋白能使神經在缺乏外源性營養(yǎng)因子的情況下長出新突起，同時增強神經可塑性、突觸重構和遞質釋放。GAP-43在神經系統(tǒng)發(fā)育過程中神經上、下通路的整合功能也是必需的。 目前，脊髓損傷的結構重建和功能恢復是醫(yī)學研究的熱點和難點。本實驗室以往的工作

6、已經研究了SCI神經細胞的病理變化，以及神經細胞凋亡的分子機制，然而關于SCI后損傷脊髓的神經修復和再生機制仍是未解決的關鍵問題。鑒于GAP-43和VEGF是重要的內源性神經營養(yǎng)因子，并且能促進神經軸突生長和再生，而且VEGF還可以改善中樞神經生長的微環(huán)境以及保護神經元減少凋亡，所以對SCI后它們在損傷脊髓的表達時間、分布以及內在神經和血管修復的作用和機制的進一步研究具有特殊的重要意義。因此，本實驗在大鼠急性脊髓損傷實驗動物模型上，應用

7、電生理技術、GAP-43和VEGF免疫組織化學的方法，研究大鼠脊髓損傷后不同時間點大鼠坐骨神經電興奮性，GAP-43與VEGF蛋白在損傷脊髓表達的變化，初步探討了GAP-43和VEGF在損傷脊髓中的作用及其可能機制。主要研究內容： 1．大鼠SCI后不同時間點坐骨神經電興奮性的改變?yōu)檠芯看笫骃CI后其功能的變化，本實驗觀察了正常大鼠、SCI后不同時間點最大刺激引起坐骨神經動作電位振幅、興奮閾值和動作電位傳導速度的變化。結果為： (

8、1)大鼠SCI后不同時間點離體坐骨神經最大動作電位振幅的變化：正常對照組最大刺激產生動作電位振幅的平均值為4.18±0.21mV，而在SCI后1d，3d，5d、7d和14d，動作電位幅值分別為1.22±0.15、3.69±0.27 mV、2.59±0.27mV、1.82±0.17 mV和0.52+0.10mV和1.22±0.15 mV。從中觀察到SCI后隨著時間的進行，坐骨神經動作電位幅度呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，以第7d為最低，第14d有明

9、顯升高。統(tǒng)計學結果表明大鼠SCI后各時間點坐骨神經動作電位幅度與正常對照組存在顯著性差異(P<0.01)，各SCI組之間也存在顯著性差異(P<0.01)。 (2)大鼠SCI后不同時間點離體坐骨神經興奮閾值的變化：正常對照組大鼠離體坐骨神經干興奮性最高，其產生動作電位的興奮閾值為0.296±0.00 V；大鼠SCI后1d、3d、5d、7d和14d，興奮閾值分別為0.302+0.011 V、0.314±0.017 v、0.374±0.028

10、 V、0.596+0.045 v和0.386+0.033V，從中看到隨大鼠SCI后時間的推移，其興奮閾值呈時間依賴性升高，其中以SCI后第7d為最高。經統(tǒng)計學處理發(fā)現(xiàn)SCI后3d、5d、7d和第14d，坐骨神經興奮閾值均明顯高于對照組，具有顯著性差異(P<0.01)。 (3)大鼠SCI)舌不同時間點離體坐骨神經動作電位傳導速度的變化：正常對照組大鼠坐骨神經干動作電位傳導速度為20.60±1.55rn/s：SCI后1d，3d，5d，7d和

11、14d傳導速度均低于對照組，分別為18.42±1.74 m/s、16.80±1.55 m/s、14.47±1.40 m/s、12.21±1.20 m/s和16.02+1.72m/s，其中以第7d為最低，第14d傳導速度有所回升。經統(tǒng)計學處理大鼠SCI后上述各時間動作電位傳導速度均較對照組存在非常顯著性差異(P<0.01)。以上結果表明大鼠SCI后離體坐骨神經的興奮性和傳導性均呈時間依賴性降低，利用這些客觀的電生理指標可以部分的反映損傷脊

12、髓的功能變化。 2.大鼠SCI后損傷脊髓GAP-43蛋白表達的變化研究表明GAP-43是神經元發(fā)育和再生的一個內在決定因子，其在損傷脊髓的表達量直接關系到損傷脊髓內在結構和功能修復的能力。本實驗用GAP-43的免疫組織化學的方法觀察了大鼠SCI后不同時間損傷脊髓中GAP.43表達的變化。結果顯示：大鼠正常脊髓神經元胞漿和軸突內有少量GAP-43蛋白顆粒出現(xiàn)，呈淺褐色，GAP-43陽性細胞數(shù)為2.53±0.77個。當大鼠SCI后

13、神經元胞體和軸突內GAP-43蛋白表達顆粒明顯增加，染色強度增加。SCI后1d、3d、5d和7d時損傷脊髓周圍區(qū)GAP-43陽性神經元數(shù)量逐漸遞增，分別為7.44±1.29個、10.71±2.17個、13.50±2.20個、16.33±2.96個和9.47±1.83個，其中以第7d GAP-43蛋白表達量最高。統(tǒng)計學結果顯示大鼠SCI后各時間點GAP-43陽性神經元數(shù)量均較對照組存在非常顯著性差異(P<0.01)。另外，還發(fā)現(xiàn)在大鼠SC

14、I后的第7d、14d時，表達GAP-43的神經元，其胞體直徑和軸突長度均較未表達GAP-43的神經元大而長。結果表明大鼠SCI后早、中期，損傷脊髓周圍區(qū)神經細胞表達GAP-43蛋白呈時間依賴性的增加，提示內源性修復性機制的存在。 3.大鼠SCI后損傷脊髓VEGF蛋白表達的變化VEGF具有促進損傷脊髓血管新生和神經細胞修復再生的作用。本實驗利用免疫組織化學方法觀察了大鼠SCI后不同時間點損傷脊髓周圍區(qū)VEGF蛋白表達的變化，結果

15、發(fā)現(xiàn)對照組脊髓結構完整，細胞分布均勻，VEGF表達極少；而在SCI后1d，3d和7d損傷脊髓周圍區(qū)大運動神經元細胞核和胞漿內均出現(xiàn)較強的VEGF蛋白表達，第3d表達量最多為20.80±6.06個，與對照組0.60±0.89個比較，存在顯著性差異：SCI后第14d和28d時VEGF只出現(xiàn)在細胞漿內，其陽性神經元數(shù)量為7.80±2.17個和2.60±1.82個，較SCI第7d時明顯下降，但仍較對照組顯著升高。在SCI后第3d損傷脊髓周圍區(qū)的

16、神經膠質細胞開始出現(xiàn)VEGF的表達，陽性神經元的數(shù)量為13.25±3.16個；14d時達高峰，為35.83±6.11個；28d時陽性神經元的數(shù)目較前減少，為21.50±4.93個；SCI各組VEGF陽性細胞數(shù)均較對照組差異非常顯著差異(P<0.01)。本實驗中VEGF在損傷脊髓血管內皮細胞上表達的變化是，在SCI后第1d損傷脊髓周圍區(qū)血管內皮細胞VEGF表達呈強陽性，在隨后的第3d、7d、14d仍有表達，而在第28d時未見表達。以上結果

17、提示這種VEGF蛋白在大鼠SCI早、中期損傷脊髓的神經元、神經膠質和血管高表達，關于其參與損傷脊髓內源性神經結構和功能修復，以及血管新生的作用及其機制有待于深入研究?？傊?，本實驗研究結果主要通過紀錄外周坐骨神經電興奮性變化，為反映SCI后損傷脊髓功能改變提供了客觀而可靠的指標，并初步證明了SCI后不同時間點損傷脊髓內源性神經及血管結構和功能修復蛋白GAP-43和VEGF的表達和分布，這對于進一步了解SCI后其損傷脊髓組織的病理分子機制，