METEORIN樣分泌性蛋白在骨組織中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、背景：骨膜下成骨作用能夠使長骨外徑增粗，皮質(zhì)骨量增加，對增強骨強度，減少骨折發(fā)生具有重要意義；并且骨膜成骨細(xì)胞對雌激素、甲狀旁腺素、機械應(yīng)力等調(diào)節(jié)骨形成的因素具有獨特的反應(yīng)性。以骨膜下成骨細(xì)胞為靶點的藥物，可能對發(fā)現(xiàn)新的抗骨質(zhì)疏松癥治療方案具有重要意義。但長久以來，骨膜下成骨細(xì)胞分化、參與骨形成的分子機制尚不清楚，對其在抗骨質(zhì)疏松癥藥物治療中的作用關(guān)注甚少。 本實驗室一直關(guān)注骨膜成骨細(xì)胞在骨形成中的作用。前期建立了骨外膜細(xì)胞的體

2、外培養(yǎng)模型，研究了雌激素對骨膜成骨細(xì)胞的作用特點；構(gòu)建了骨膜cDNA文庫和雌激素作用前后骨外膜細(xì)胞差異表達(dá)基因文庫，并完成了兩個文庫的大規(guī)模的測序。 目的：本研究利用骨膜cDNA文庫和雌激素作用前后骨外膜細(xì)胞差異表達(dá)基因文庫的基因序列信息，對骨膜成骨細(xì)胞中表達(dá)的未知功能基因進(jìn)行了克隆和篩選，并詳細(xì)研究感興趣基因在骨組織中的表達(dá)規(guī)律，初步探索其在成骨細(xì)胞骨形成中的作用，從而可以深入了解骨膜下成骨細(xì)胞骨形成機制、尋找新的促進(jìn)骨形成的

3、藥物打下基礎(chǔ)。 方法： 第一部分、骨膜成骨細(xì)胞中新功能基因高通量的篩選 (1)基因克隆：目的基因序列來源于骨膜cDNA文庫和雌激素作用前后骨膜細(xì)胞差減庫，以PCR方法擴增未知功能基因蛋白編碼區(qū)并構(gòu)建真核表達(dá)載體； (2)利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)篩選影響信號通路的基因：利用共轉(zhuǎn)染技術(shù)，將螢火蟲熒光素酶報告基因載體(pAP1-luc/pNFAT-luc/pCRE-luc/pNFkB-luc/pStat-lu

4、c)、內(nèi)參照水母熒光素表達(dá)載體、未知功能基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入工程細(xì)胞293T細(xì)胞中，檢測無信號通路刺激物和有信號通路刺激物時，未知功能基因?qū)ξ灮鹣x熒光素酶報告基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。 第二部分、METRNL生物信息學(xué)分析 對上一步發(fā)現(xiàn)的能夠影響信號通路的基因METRNL進(jìn)行啟動子結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)、保守序列比對等信息分析。 第三部分、METRNL細(xì)胞及組織表達(dá)定位 (1)METRNL基因原核蛋白表達(dá)、純化及多克隆抗

5、體制備； (2)蛋白細(xì)胞定位：通過pEGFP熒光報告基因法和間接免疫熒光檢測METRNL蛋白在MG63細(xì)胞中的定位；通過western blot檢測轉(zhuǎn)染METRNL的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清中METRNL蛋白的表達(dá)情況； (3)組織表達(dá)：利用northern blot檢測多種組織中METRNL mRNA的表達(dá)情況。 第四部分、肛TRNL在骨組織表達(dá)特點及其對成骨功能影響 (1)骨組織表達(dá)：利用免疫組織化學(xué)法，檢

6、測不同年齡大鼠骨組織中METRNL蛋白的表達(dá)規(guī)律； (2)成骨功能影響：建立穩(wěn)定過表達(dá)METRNL的MG63細(xì)胞，檢測在成骨誘導(dǎo)條件下礦化結(jié)節(jié)形成、成骨相關(guān)標(biāo)記物ALP、OPG的表達(dá)情況。 結(jié)果： 第一部分： 成功建立5個未知功能基因編碼區(qū)的真核表達(dá)載體；通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)篩選發(fā)現(xiàn)METRNL號基因即METRNL與報告基因共轉(zhuǎn)染后，未加刺激物時AP1的轉(zhuǎn)錄活性與對照組相比下降達(dá)74％，加入信號通路

7、刺激物后，同樣能夠顯著抑制AP1的轉(zhuǎn)錄活性；另外，METRNL也可以顯著抑制轉(zhuǎn)錄因子NFAT和CRE的轉(zhuǎn)錄活性。 第二部分： 信息分析顯示，METRNL蛋白有311氨基酸組成，N端45個氨基酸可能是信號肽，METRNL可能是一種分泌性蛋白；蛋白功能預(yù)測METRNL不存在與已知蛋白模體或序列相似的結(jié)構(gòu)。 第三部分： (1)利用原核表達(dá)體系成功純化了METRNL蛋白83-311位氨基酸組成的多肽片段，免疫大白

8、兔后獲得多克隆抗體，抗體效價達(dá)1：5×10<'4>。 (2)細(xì)胞定位研究顯示MG63細(xì)胞中，METRNL主要出現(xiàn)于細(xì)胞漿中，胞核無表達(dá)；轉(zhuǎn)染METRNL的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)過濃縮后能夠檢測到METRNL蛋白的存在，提示METRNL是分泌性蛋白。 (3)Northern blot結(jié)果顯示，METRNL的mRNA約長1500bp，可在成人腦、心、肝臟、腎臟、脾臟、卵巢、子宮、骨骼肌等8個組織中表達(dá)，但表達(dá)量較低。

9、 第四部分： (1)骨組織免疫組化顯示，METRNL皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨骨表面的成骨細(xì)胞中，METRNL呈陽性表達(dá)。隨著成骨細(xì)胞分化成熟，被骨基質(zhì)包埋，成為骨細(xì)胞后，METRNL表達(dá)降低，甚至呈陰性表達(dá)；生長板肥大軟骨細(xì)胞中METRNL染色陽性，而增殖軟骨細(xì)胞無表達(dá)。不同年齡段大鼠相比較發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增加，METRNL表達(dá)呈下降趨勢。提示METRNL主要表達(dá)于活躍骨形成部位，可能參與調(diào)控骨形成； (2)過表達(dá)METRNL的MG

10、63在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液條件下，骨結(jié)節(jié)形成數(shù)較轉(zhuǎn)染空載體的對照組降低；成骨細(xì)胞早期標(biāo)記物ALP的量在誘導(dǎo)后持續(xù)增加，不隨時間延長而降低；而成熟成骨細(xì)胞標(biāo)記物OPG，則較對照組明顯降低。提示METRNL基因過表達(dá)使MG63處于活躍的骨基質(zhì)形成期，但未能進(jìn)一步向骨基質(zhì)礦化期進(jìn)展。 結(jié)論： (1)METRNL是成骨細(xì)胞分泌的一種新的功能蛋白； (2)METRNL可能通過AP-1、NFAT、CRE等多條信號通路發(fā)揮作用；