外源性全反視黃酸對(duì)豚鼠屈光狀態(tài)和眼發(fā)育影響的研究.pdf

1、第一部分.外源性全反視黃酸對(duì)豚鼠屈光狀態(tài)和眼后部組織發(fā)育的影響研究 目的:觀察豚鼠球周注射全反視黃酸(all-transretinoicacid，ATRA)對(duì)屈光狀態(tài)和眼后部組織發(fā)育的影響。方法:選取四周齡英國短毛豚鼠48只，分為ATRA組(n=24)和正常對(duì)照組(n=24)。ATRA組隨機(jī)選取一眼(n=24)于暗光下球周注射0．4mg／mL濃度全反視黃酸O．1mL。對(duì)照組隨機(jī)選擇一眼(n=24)同法球周注射稀釋ATRA用的相應(yīng)

2、濃度二硝基亞楓(DMSO，0．001ml／L)和注射用水0．1mL。注射前及注射后四周分別測(cè)兩組的屈光度、玻璃體腔深度和眼軸長度，并取注射后四周及八周每組各6只眼球做病理檢查。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)為組間T檢驗(yàn)。結(jié)果:注射前ATRA眼平均屈光度為3．73Di0．75D，玻璃體腔深度3．09mm~0．67mm，眼軸長6．44mm+0．27mm；對(duì)照眼平均屈光度為3．72D+0．83D，玻璃體腔深度3．19mm~0．74mm，眼軸長為6．54mme0．

3、38mm，ATRA眼和對(duì)照眼間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0．96；0．68及0．26)。注射四周后對(duì)照眼屈光度為3．56D~0．80D，玻璃體腔深度為3．57mm~0．54mm，眼軸長為7．80mm~0．26mm，ATRA眼屈光度為0．90D~1．25D，玻璃體腔深度為3．98mm~0．68mm，眼軸長為8．50mm~0．39mm。ATRA眼和對(duì)照眼各參數(shù)間比較差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(三者均P

4、長量與對(duì)照眼的相比差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(分別為2．04~0．06mm和1．24+0．04mm，t檢驗(yàn)：P<0．001)；注射四周后ATRA眼玻璃體腔深度增加較對(duì)照眼差異也具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0．89~0．05mm和0．36~0．04mm，t檢驗(yàn)：P<0．001)。病理切片以Leica顯微鏡圖像分析系統(tǒng)測(cè)量示注射四周后ATRA處理眼的鞏膜厚度為124．39~6．48gm，脈絡(luò)膜為42．21~2．32pm；正常對(duì)照眼的鞏膜厚度為83

5、．59~5．28ltm，脈絡(luò)膜為92．83~8．26gm；八周后ATRA眼的鞏膜厚度為81．62~12．96gm，脈絡(luò)膜為44．53~4．16gm；正常對(duì)照眼的鞏膜厚度為¨8．53~6．30[tm，脈絡(luò)膜為162．98~21．87gm。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)提示注射后四周及八周的、ATRA眼較對(duì)照眼后極部相似部位的脈絡(luò)膜變薄(P值分別為8．34×10-1。和7．32×lfils，均<0．001)，注射后四周鞏膜層厚度增加(P=4．38×10-14，

6、<0．001)，注射后八周變薄(P=2．77×10一，<0．001)。結(jié)論:局部外源性應(yīng)用一定濃度的全反視黃酸可誘導(dǎo)豚鼠相對(duì)性近視漂移。并可觀察到脈絡(luò)膜變薄和玻璃體腔的深度增加等現(xiàn)象。 第二部分.形覺剝奪和外源性全反視黃酸對(duì)豚鼠錐細(xì)胞視蛋白表達(dá)的影響對(duì)比研究 目的:觀察一定濃度的外源性ATRA對(duì)豚鼠錐細(xì)胞視蛋白表達(dá)的影響，并與形覺剝奪性近視豚鼠的錐細(xì)胞視蛋白表達(dá)進(jìn)行比較。方法:出生一周豚鼠42只，分為ATRA組(n=14

7、)，正常對(duì)照組(n=14)，形覺剝奪(Formdeprivedmyopia，F(xiàn)DM)組(n=14)，按自然亮暗周期飼養(yǎng)。視黃酸組隨機(jī)選取一眼于暗光下球周注射0．4mg／mL濃度ATRA0．1mL，F(xiàn)DM組隨機(jī)選取一眼以半透明橡膠遮蓋，對(duì)照組隨機(jī)選擇一眼球周注射稀釋ATRA用的相應(yīng)濃度二硝基亞楓(O．001ml／L)和注射用水共0．1mL。四周后取眼球行RT一PCR技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)視網(wǎng)膜M一視蛋白和S一視蛋白的mRNA表達(dá)，并進(jìn)行豚鼠視網(wǎng)膜鋪

8、片后免疫組織化學(xué)方法觀察兩種視蛋白的分布和表達(dá)密度，一抗為兔抗鼠紅／綠錐視蛋白抗體或藍(lán)錐視蛋白抗體，二抗為羊抗兔IgG帶488熒光抗體。以Zeiss熒光顯微鏡和Leica共聚焦顯微鏡觀察豚鼠視網(wǎng)膜腹側(cè)(下方)和背側(cè)(上方)及中央?yún)^(qū)的錐細(xì)胞視蛋白的表達(dá)。結(jié)果正常豚鼠的視網(wǎng)膜短波敏感錐細(xì)胞(Shonwave-lengthsensitiveopsin，S-opsin)分布為腹側(cè)(下方)多于背側(cè)(上方)；中央密度最高，密度變化為突變。豚鼠的中波

9、敏感錐細(xì)胞(Mediumwave-lengthsensitiveopsin，M-cone)分布在背部(上方)多于腹側(cè)(下方)，中央密度最高，密度變化為漸變；正常組S-opsin的表達(dá)密度：下方為805．0ITIIll-2±203．3mm-2，上方為100．0mm-2±57．7mm~；中央為1637．2mm-2~314．1mm-2。ATRA組：下方為499．4mm'2±147．6mm-2，上方為87．8mm-2+44．9mm'2，中央為9

10、68．4mm'2+210．2mm'2；FDM組：下方為640．9mm'2+196．8llllrl'2；中央為：1016．7mm-2+144．6mm-2，上方為70．9mm-2+30．8nlra-2；正常組M-opsin的表達(dá)密度：上方為946．2mm-2+388．5111111-2，中心為1666．7mm-Z+137．8mm'z，下方為175．0mm'2-4-100．9mm'2；ATRA組：上方為1326．1mm'2+267．0iBnl

11、-2，中心為2984．0mm-2+613．4mm-2，下方為232．9mm-2+173．6mln-2；FDM組：上方為1436．7mm'2+366．0mnl-2，中心為：2780．0mm'2±180．5II]IB'2，下方為318．2mm-％172．7II]IB-2。FDM和0．4mg／ml濃度的ATRAO．1ml局部球周注射用后均使豚鼠視網(wǎng)膜的M-opsin的表達(dá)密度均較正常對(duì)照增加(二者均P<0．05)，S-opsin的表達(dá)密度減少

12、(二者均P<0．05)；RT-PCR檢測(cè)示M．視蛋白的相對(duì)光密度值為1．254-0．¨(ATRA眼)，1．064-0．07(FDM眼)，0．514-0．10(對(duì)照眼)，S視蛋白的相對(duì)光密度值為0．614,0．09(ATRA眼)，0．704-0．07(FDM眼)，1．254-0．06(對(duì)照眼)。FDM眼與對(duì)照眼，ATRA處理眼與對(duì)照眼相比，M視蛋白的mRNA表達(dá)均增加，S視蛋白的mRNA表達(dá)均下降，兩因素方差分析示兩組實(shí)驗(yàn)處理眼與對(duì)照眼的

13、差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。結(jié)論:錐細(xì)胞視蛋白的表達(dá)改變可能在豚鼠形覺剝奪性近視中起了作用。ATRA對(duì)感光細(xì)胞發(fā)育具有靶向性作用。一定濃度的ATRA球周局部作用后豚鼠錐細(xì)胞視蛋白的mRNA表達(dá)及分布和表達(dá)密度的改變與形覺剝奪性近視眼較為相似，支持ATRA在豚鼠屈光狀態(tài)發(fā)育的信使作用。 第三部分.全反視黃酸對(duì)培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的作用研究 目的:觀察ATRA對(duì)培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(Retinalpigme

14、ntepithelium，RPE)的形態(tài)、增殖的影響以及對(duì)RPE細(xì)胞表達(dá)和分泌轉(zhuǎn)化生長因子一β2(Transforminggrowthfactor-β2，TGF-p2)的影響。方法:RPE傳代至第三代后以1水105／孔的密度接種于96孔板或以1*10。的密度接種于250ml培養(yǎng)瓶，以10％FBS的F12培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時(shí)后轉(zhuǎn)為0．5％FBS的F12培養(yǎng)液，12小時(shí)后培養(yǎng)液轉(zhuǎn)換為F12和1nM／mL，5nM／mL，10nM／mL，20nM

15、／mL，30nM／mL的ATRA。以未加ATRA但加入溶解ATRA的相應(yīng)濃度DMSO作正常對(duì)照。48小時(shí)后觀察RPE細(xì)胞形態(tài)，并以MTT法測(cè)定其增殖情況，以流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其細(xì)胞凋亡。以免疫組化方法檢測(cè)RPE細(xì)胞TGF-β2表達(dá)并以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedimmunoadsordentassay,ELISA)方法測(cè)定其上清液的TGF-B2濃度。結(jié)果:不同ATRA的濃度對(duì)RPE細(xì)胞的形態(tài)，增殖有不同的影響。1nM／mL

16、，5nM／mL的ATRA對(duì)RPE細(xì)胞的增殖無影響，細(xì)胞形態(tài)正常，MTT法顯示這些濃度下ATRA對(duì)RPE的增殖影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0．05)；10nM／mL，20nM／mL，30nM／mL的ATRA抑制RPE的增殖，MTT法顯示ATRA對(duì)RPE有明顯的抑制作用(三種濃度下p值分別為p<0．05，p<0．01，p<0．001)。該效應(yīng)呈濃度依賴性反應(yīng)。RPE細(xì)胞增大變平，突起減少；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)提示10nM／mL，20nM／mL，30n

17、M／mL濃度下細(xì)胞凋亡率分別為14．58％，19．95％和21．69％。免疫組化方法檢測(cè)提示，加入RPE細(xì)胞的ATRA濃度大于10nM／mL時(shí),TGF-β2的表達(dá)隨著其濃度增高而增加，ELISA結(jié)果提示，ATRA濃度大于10nM／mL時(shí)，RPE分泌TGF-β2的濃度增加。結(jié)論:一定濃度的ATRA可維持培養(yǎng)的人RPE的生長，10nM／ml及以上的濃度引起RPE的增殖抑制，并可誘導(dǎo)RPE的凋亡。10nM／mL及以上濃度的ATRA誘導(dǎo)RPE的