芯片技術(shù)用于肺癌患者APC基因啟動(dòng)子1A多位點(diǎn)甲基化定量檢測(cè).pdf

1、背景：肺癌由于缺乏有效的早期診斷方法，即使在發(fā)達(dá)國(guó)家，5年生存率也低于15﹪。高甲基化是導(dǎo)致抑癌基因失活的重要機(jī)制，現(xiàn)已證實(shí)，啟動(dòng)子區(qū)高甲基化導(dǎo)致抑癌基因失活是人類肺癌的共同特征。APC是一種抑癌基因，其啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)。研究顯示，肺癌患者APC基因啟動(dòng)子區(qū)存在較高的甲基化。因此推斷，檢測(cè)APC啟動(dòng)子區(qū)甲基化，對(duì)于肺癌的早期診斷可能具有重要意義。目前最常用的甲基化檢測(cè)技術(shù)，如亞硫酸氫鈉/測(cè)序法、甲基化特異性PCR、原

2、位-MSP雜交、單鏈核苷酸引物延伸法、變性高效液相色譜法等都無法對(duì)多位點(diǎn)進(jìn)行甲基化定量檢測(cè)，甲基化定量檢測(cè)芯片的出現(xiàn)解決了這一難題。 目的：建立抑癌基因APC啟動(dòng)子1A的甲基化定量芯片檢測(cè)方法，對(duì)肺癌患者及正常人的臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，探討肺癌患者APC基因的甲基化模式及甲基化雜合型狀態(tài)。 方法：選取一段420bp的APC基因啟動(dòng)子1A部位中CpG密集序列作為靶序列，針對(duì)687、707、714、719和726共5個(gè)CpG靶位

3、點(diǎn)，設(shè)計(jì)一套檢測(cè)甲基化與非甲基化的探針。經(jīng)過玻片的清洗及硅烷化、手臂分子的聯(lián)接、探針的點(diǎn)樣及固定等多個(gè)步驟制備甲基化芯片。將人臍帶血經(jīng)過DNA提取、轉(zhuǎn)甲基、亞硫酸鹽修飾、質(zhì)粒克隆重組等步驟后建立陽性、陰性質(zhì)控品，按照質(zhì)量百分比0﹪、25﹪、50﹪、75﹪、100﹪混合后，檢測(cè)分析，建立了甲基化定量檢測(cè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且確定了非甲基化與雜合型的甲基化率檢測(cè)范圍。提取2例正常人的外周血淋巴細(xì)胞DNA、14例正常人的肺組織DNA、28例肺

4、癌患者的56份腫瘤和正常肺組織DNA，進(jìn)行亞硫酸鹽化學(xué)修飾，以甲基化特異性引物進(jìn)行基因擴(kuò)增后，與探針雜交，定量檢測(cè)分析，并同時(shí)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行甲基化特異性序列分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS10.5四格表法分析。 結(jié)果：甲基化陰性、陽性質(zhì)控品的芯片檢測(cè)與測(cè)序結(jié)果吻合。五個(gè)位點(diǎn)的熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2介于0.93～0.99之間。687、707、714、719和726共5個(gè)位點(diǎn)非甲基化的檢測(cè)范圍分別是：0﹪±8.7﹪、0﹪±17.6

5、﹪、0﹪±17﹪、0﹪±13﹪、0﹪±8﹪；甲基化雜合型的檢測(cè)范圍分別是：50﹪±3.6﹪、50﹪±6.9﹪、50﹪±3.5﹪、50﹪±8.5﹪、50﹪±7.3﹪。687、707、714、719和726共5個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化率與雜合型及其范圍以上的甲基化發(fā)生率從低到高依次是，正常人、肺癌患者的正常肺組織、肺癌患者的腫瘤組織。正常人與肺癌患者的正常肺組織和腫瘤組織707、714、719和726共4個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化率差異均有顯著性；肺

6、癌患者的腫瘤與肺癌患者的正常肺組織5個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化率與雜合型及其范圍以上的甲基化發(fā)生率差異均無顯著性；正常人與肺癌患者正常肺組織707、714位點(diǎn)的雜合型及其范圍以上的甲基化發(fā)生率有顯著性差異；正常人與肺癌患者腫瘤組織707、714、719、726共4個(gè)位點(diǎn)的雜合型及其范圍以上的甲基化發(fā)生率有顯著性差異。肺癌患者5個(gè)位點(diǎn)的甲基化率與雜合型及其范圍以上的甲基化發(fā)生率是，位點(diǎn)687最低，707、714最高。肺癌患者正常肺組織位點(diǎn)687

7、與位點(diǎn)707、714之間的甲基化率有顯著性差異；肺癌患者腫瘤組織位點(diǎn)687與位點(diǎn)707、714、719、726之間的甲基化率有顯著性差異；肺癌患者位點(diǎn)687與707、714之間的雜合型及其范圍以上的甲基化發(fā)生率有顯著性差異。肺癌患者中存在甲基化雜合型狀態(tài)，結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。 結(jié)論：本研究建立了APC基因啟動(dòng)子1A區(qū)5個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化定量檢測(cè)芯片，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多位點(diǎn)甲基化的定量檢測(cè)。本研究以甲基化芯片技術(shù)對(duì)肺癌標(biāo)本進(jìn)行了定量檢測(cè)