AR、Bax-Bcl-2、PPARγ基因表達與大鼠糖尿病腎病關系的探討.pdf

1、目的 1建立DM大鼠模型，優(yōu)化AR活性熒光測定法的條件并動態(tài)觀察DM大鼠AR活性的變化。 2檢測DM大鼠腎臟AR、Bax/Bcl-2、PPARγ的基因表達情況，進一步分析三者基因表達變化的內在聯(lián)系，探討它們與DN發(fā)病機理的關系。 方法 1優(yōu)化AR活性的熒光測定法，并動態(tài)觀察DM大鼠AR活性。 1.1用STZ復制DM大鼠模型，并按病程分為DM20、40、60d組。 1.2比較測定AR活性的兩

2、種熒光法(NADP生成法和NADPH減少法)的靈敏度和重復性。 1.3選擇其中較優(yōu)的一種方法進一步觀察血紅蛋白對熒光是否有影響。 1.4將AR活性的熒光測定法進行優(yōu)化。 1.5應用優(yōu)化后的熒光法動態(tài)觀察DM大鼠紅細胞及腎臟AR活性。 2AR、Bax/Bcl-2、PPARγ基因表達的變化及其與DN關系的探討。 2.1PAS染色觀察DM大鼠組織切片。 2.2RT-PCR法檢測AR、Bax/Bc

3、l-2以及PPARγ的基因表達情況。 2.3NorthernBlot進一步證實上述基因在不同組間表達的變化。 2.4分析這些基因表達變化的相關性，探討它們與DN發(fā)病機理的關系。 結果 1.1NADP生成法測定AR活性的靈敏度高、重復性好。 1.2血紅蛋白對熒光有影響，高氯酸將其沉淀后可消除這種影響。 1.3NADP生成法優(yōu)化為：135mMPBS，100mM硫酸銨，0.04mMDL-甘油醛，

4、150μMNADPH，5μl紅細胞溶血液/20μl組織勻漿液，總體積200μl，實驗管加上述所有試劑，空白管以雙蒸水代替NADPH；37℃水浴5min反應，加入600μl0.5MHCl，60℃水浴15min終止反應，然后加6％高氯酸250μl，2500rpm離心10min，上清液中加入6.67MNaOH(內含10mM咪唑)1.8ml，激發(fā)熒光即刻測定。 1.4蹦大鼠紅細胞和腎臟AR活性隨病程延長有增高的趨勢；同一大鼠腎臟AR活性

5、大于紅細胞AR活性；血糖與紅細胞及腎臟AR活性均相關(r值分別為0.995和0.983)，紅細胞AR活性與腎臟AR活性亦相關(r=0.995)。 2.1PAS染色：隨病程進展腎小球系膜區(qū)及毛細血管基底膜PAS陽性物質逐漸增多，DM60組系膜區(qū)細胞成分略減少。 2.2RT-PCR結果示，DM大鼠隨病程延長AR表達有增高的趨勢，DM60組增高尤其顯著(DM60vsDM40：P=0.014，DM60vsDM20：P=0.014

6、，DM60vs正常組：P=0.011)；Bax表達亦有增高趨勢；Bcl-2基因在正常組全部(10/10)擴增出目的片斷，DM20、DM40、DM60組分別有5/10、3/10、2/10擴增出目的片斷；PPARγ基因在正常組、DM20、DM40組分別有8/10、4/10、4/10擴增出目的片斷，DM60組的標本未能擴增出目的片斷。 2.3NorthernBlot證實DM大鼠隨病程延長AR、Bax表達逐步增高，Bcl-2表達逐步降低

7、。NorthernBlot未能檢測到PPARγ雜交信號。 2.4據RT-PCR結果分析AR與Bax正相關(r=0.80)，Bcl-2與PPARγ相關。 結論 1NADP生成法較NADPH減少法簡便、靈敏、穩(wěn)定。優(yōu)化后的NADP生成法更能準確測定AR活性。 2STZ誘導DM大鼠(55mg/kg體重)20天時紅細胞AR活性即增高，40天時腎臟AR活性也增高，且DM大鼠紅細胞和腎臟AR活性隨病程延長有增加的趨勢