AR、Bax-Bcl-2、PPARγ基因表達(dá)與大鼠糖尿病腎病關(guān)系的探討.pdf

1、目的 1建立DM大鼠模型，優(yōu)化AR活性熒光測(cè)定法的條件并動(dòng)態(tài)觀察DM大鼠AR活性的變化。 2檢測(cè)DM大鼠腎臟AR、Bax/Bcl-2、PPARγ的基因表達(dá)情況，進(jìn)一步分析三者基因表達(dá)變化的內(nèi)在聯(lián)系，探討它們與DN發(fā)病機(jī)理的關(guān)系。 方法 1優(yōu)化AR活性的熒光測(cè)定法，并動(dòng)態(tài)觀察DM大鼠AR活性。 1.1用STZ復(fù)制DM大鼠模型，并按病程分為DM20、40、60d組。 1.2比較測(cè)定AR活性的兩

2、種熒光法(NADP生成法和NADPH減少法)的靈敏度和重復(fù)性。 1.3選擇其中較優(yōu)的一種方法進(jìn)一步觀察血紅蛋白對(duì)熒光是否有影響。 1.4將AR活性的熒光測(cè)定法進(jìn)行優(yōu)化。 1.5應(yīng)用優(yōu)化后的熒光法動(dòng)態(tài)觀察DM大鼠紅細(xì)胞及腎臟AR活性。 2AR、Bax/Bcl-2、PPARγ基因表達(dá)的變化及其與DN關(guān)系的探討。 2.1PAS染色觀察DM大鼠組織切片。 2.2RT-PCR法檢測(cè)AR、Bax/Bc

3、l-2以及PPARγ的基因表達(dá)情況。 2.3NorthernBlot進(jìn)一步證實(shí)上述基因在不同組間表達(dá)的變化。 2.4分析這些基因表達(dá)變化的相關(guān)性，探討它們與DN發(fā)病機(jī)理的關(guān)系。 結(jié)果 1.1NADP生成法測(cè)定AR活性的靈敏度高、重復(fù)性好。 1.2血紅蛋白對(duì)熒光有影響，高氯酸將其沉淀后可消除這種影響。 1.3NADP生成法優(yōu)化為：135mMPBS，100mM硫酸銨，0.04mMDL-甘油醛，

4、150μMNADPH，5μl紅細(xì)胞溶血液/20μl組織勻漿液，總體積200μl，實(shí)驗(yàn)管加上述所有試劑，空白管以雙蒸水代替NADPH；37℃水浴5min反應(yīng)，加入600μl0.5MHCl，60℃水浴15min終止反應(yīng)，然后加6％高氯酸250μl，2500rpm離心10min，上清液中加入6.67MNaOH(內(nèi)含10mM咪唑)1.8ml，激發(fā)熒光即刻測(cè)定。 1.4蹦大鼠紅細(xì)胞和腎臟AR活性隨病程延長(zhǎng)有增高的趨勢(shì)；同一大鼠腎臟AR活性

5、大于紅細(xì)胞AR活性；血糖與紅細(xì)胞及腎臟AR活性均相關(guān)(r值分別為0.995和0.983)，紅細(xì)胞AR活性與腎臟AR活性亦相關(guān)(r=0.995)。 2.1PAS染色：隨病程進(jìn)展腎小球系膜區(qū)及毛細(xì)血管基底膜PAS陽性物質(zhì)逐漸增多，DM60組系膜區(qū)細(xì)胞成分略減少。 2.2RT-PCR結(jié)果示，DM大鼠隨病程延長(zhǎng)AR表達(dá)有增高的趨勢(shì)，DM60組增高尤其顯著(DM60vsDM40：P=0.014，DM60vsDM20：P=0.014

6、，DM60vs正常組：P=0.011)；Bax表達(dá)亦有增高趨勢(shì)；Bcl-2基因在正常組全部(10/10)擴(kuò)增出目的片斷，DM20、DM40、DM60組分別有5/10、3/10、2/10擴(kuò)增出目的片斷；PPARγ基因在正常組、DM20、DM40組分別有8/10、4/10、4/10擴(kuò)增出目的片斷，DM60組的標(biāo)本未能擴(kuò)增出目的片斷。 2.3NorthernBlot證實(shí)DM大鼠隨病程延長(zhǎng)AR、Bax表達(dá)逐步增高，Bcl-2表達(dá)逐步降低

7、。NorthernBlot未能檢測(cè)到PPARγ雜交信號(hào)。 2.4據(jù)RT-PCR結(jié)果分析AR與Bax正相關(guān)(r=0.80)，Bcl-2與PPARγ相關(guān)。 結(jié)論 1NADP生成法較NADPH減少法簡(jiǎn)便、靈敏、穩(wěn)定。優(yōu)化后的NADP生成法更能準(zhǔn)確測(cè)定AR活性。 2STZ誘導(dǎo)DM大鼠(55mg/kg體重)20天時(shí)紅細(xì)胞AR活性即增高，40天時(shí)腎臟AR活性也增高，且DM大鼠紅細(xì)胞和腎臟AR活性隨病程延長(zhǎng)有增加的趨勢(shì)