哈維弧菌表面抗原的克隆和真核表達(dá).pdf

1、哈維弧菌(Vibrio harveyi)是一種能產(chǎn)生單極端鞭毛的革蘭氏陰性桿菌,是海水養(yǎng)殖中常見的致病菌,由其引起的弧菌病是水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟動物中最為嚴(yán)重的疾病之一,造成巨大的經(jīng)濟損失。外膜蛋白(outer membrane proteins,Omps)是革蘭氏陰性菌特有的外膜的主要結(jié)構(gòu)成份,在維持細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、細(xì)胞的物質(zhì)交換及細(xì)菌的致病過程中起著十分重要的作用,同時,部分病原菌的外膜蛋白有良好的免疫原性,可以刺激機體的發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)

2、,可能作為疫苗的有效成份。
　　 根據(jù)已發(fā)表的哈維弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白OmpU的基因序列設(shè)計1對特異性引物,應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法,自哈維弧菌致病菌株基因組中擴增獲得一段約1000 bp的序列,構(gòu)建重組載體pMD18-T-OmpU,測序結(jié)果表明,該基因與已發(fā)表的哈維弧菌外膜蛋白OmpU基因序列存在98％以上的相似性。該序列在GenBank上的登錄號為FJ919231。構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET30(a)

3、-OmpU后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli BL21(DE3),在IPTG誘導(dǎo)下實現(xiàn)高效表達(dá),SDS-PAGE顯示重組蛋白分子質(zhì)量約為41 kD,與預(yù)期基本相符。重組蛋白以包涵體形式表達(dá)。以尿素法得到初步純化的重組蛋白,以50μg/mL的劑量注射免疫大黃魚幼魚,經(jīng)間接ELISA法檢測了4～8周后特異性抗體的效價,同時檢測了注射后4周的免疫保護率。結(jié)果表明,4～8周內(nèi)特異性抗體效價持續(xù)升高,達(dá)到log28.0以上,4周時的相對免疫保護率為85

4、％。試驗結(jié)果顯示了重組哈維弧菌外膜蛋白OmpU具有良好的免疫原性,可能作為亞單位疫苗的開發(fā)對象。
　　 根據(jù)溶藻弧菌外膜蛋白OmpU的基因序列設(shè)計一對引物,應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法,從患病鱸魚分離的溶藻弧菌zj2007株基因組中擴增獲得一段約960bp的序列。測序結(jié)果證明該序列是溶藻弧菌外膜蛋白OmpU基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)定向克隆連接到原核表達(dá)載體pET30(a),構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET30(a)-VAOmpU,并轉(zhuǎn)化大腸

5、桿菌E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,添加一定量的IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE圖譜檢測到重組蛋白獲得大量表達(dá)。Bandscan分析重組蛋白的分子量為48.49kDa,略高于預(yù)期分子量(40.49kDa)。為進(jìn)一步進(jìn)行溶藻弧菌OmpU的免疫原性研究打下了基礎(chǔ)。
　　 根據(jù)已發(fā)表哈維弧菌外膜蛋白OmpW的基因序列設(shè)計一對特異性引物,應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法,從患病鱸魚分離的哈維弧菌zj2008株基因組中擴增獲得

6、一段約600bp的序列。將其克隆到pET30(a)原核表達(dá)載體,測序結(jié)果證明該序列是哈維弧菌外膜蛋白OmpW基因。將重組質(zhì)粒pET30(a)-OmpW轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliBL21表達(dá)菌株,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后大量表達(dá)了目的蛋白；Bandscan分析重組蛋白的分子量為28kDa,與預(yù)期分子量(26.69kDa)基本相符。本研究為進(jìn)一步進(jìn)行哈維弧菌OmpW的免疫原性研究打下了基礎(chǔ)。
　　 作為真核細(xì)胞,在畢赤酵母中表達(dá)中表達(dá)蛋白有

7、這很多優(yōu)點,例如,蛋白質(zhì)加工,折疊和修飾。這些操作就像在大腸桿菌和釀酒酵母中一樣簡單。其比其他真核表達(dá)系統(tǒng)如桿狀病毒或哺乳動物組織培養(yǎng)液低廉,快速,簡單,并且通常能有很高的表達(dá)水平。這些優(yōu)點使畢赤酵母成為一種非常實用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。
　　 根據(jù)已知的基因序列,設(shè)計一對加入EcoRⅠ和NoteⅠ的引物,從本實驗室保存的哈維弧菌zj2008的基因組中擴增出600bp左右的OmpW片段,雙酶切PCR產(chǎn)物和pPIC9K質(zhì)粒,建立連接體系