透性化肝素黃桿菌的固定化及其降解肝素的研究.pdf

1、肝素屬長鏈糖胺聚糖（GAG），由硫酸化的葡糖胺和己糖醛酸以β—1，4糖苷鍵交叉連接而成。低分子量肝素（LMWH）則是采用不同方法降解肝素獲得的寡糖片段。與肝素相比，LMWH具有選擇性強、抗血栓作用增強等特點，在臨床上應用越來越廣泛。不同降解方法所得到的肝素寡糖具有不同的結(jié)構(gòu)，從而具有不同的生物學活性。與化學降解法相比，酶降解法制備LMWH具有反應條件溫和、酶切位點清楚、不改變肝素結(jié)構(gòu)以及不引入異物等特點。肝素裂解酶是一類能夠特異性裂解肝

2、素和類肝素主鏈糖苷鍵的酶，最初是從肝素黃桿菌中發(fā)現(xiàn)并分離出的。肝素酶的穩(wěn)定性差，對其純化過程會造成酶活性的巨大損失，因而產(chǎn)率很低。固定化酶技術(shù)因為可以克服酶穩(wěn)定性差、易失活、不能重復利用等問題而備受關(guān)注。本研究以兩株肝素黃桿菌為材料，在對其進行透性化處理提高通透性的基礎上研究其最佳固定化條件，對制得的固定化細胞的理化性質(zhì)進行研究，并進一步研究了固定化肝素黃桿菌降解肝素制備LMWH的反應條件、產(chǎn)物性質(zhì)等，結(jié)果表明固定化細胞具有較好的操作穩(wěn)

3、定性和貯藏穩(wěn)定性，在合適的反應條件下能夠制備分子量較為均一、活性較好的LMWH。主要研究內(nèi)容如下： ⑴完整的肝素酶活性測定體系的建立使用天青A（Azure A）法建立了肝素含量標準曲線，進而建立了完整的肝素酶粗酶液、透性化肝素黃桿菌以及固定化肝素黃桿菌的肝素酶活性測定體系，確保對酶活水平的測定貫穿整個研究的各個階段，以準確地計算酶活回收率以及穩(wěn)定性，作為考查粗酶液、透性化細胞以及固定化細胞的重要指標。 ⑵肝素黃桿菌的培養(yǎng)

4、及誘導條件的確定將兩株肝素黃桿菌分別接種于DSMZ培養(yǎng)基和NBRC培養(yǎng)基，測定其生長曲線，選擇NBRC培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；將菌種于30℃、200r/min條件下培養(yǎng)一定時間至培養(yǎng)液OD600為1．0左右時加入無菌的肝素鈉溶液進行誘導，通過對不同濃度肝素鈉溶液誘導產(chǎn)酶的研究，確定誘導用肝素鈉溶液的濃度為0．1 g/mL；為確保肝素黃桿菌保持菌株的純正與較高的酶活水平，確定了使用初步篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)、鏡檢、測定肝素酶活性和肝素酶I基因HepA P

5、CR鑒定的多角度機制的菌種鑒定方法；分別使用超聲波細胞破碎法和高壓勻質(zhì)法對培養(yǎng)和誘導后的肝素黃桿菌菌體進行破碎，得到肝素酶粗酶液，比較了兩種方法破碎細胞的效果，確定使用高壓勻質(zhì)法制備肝素酶粗酶液；對粗酶液的操作穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性進行研究，結(jié)果表明粗酶液的酶活穩(wěn)定性較差，反應5次后酶活性降低至10％以下，而保存于4℃時酶活性逐步降低，貯存120 h后酶活性降至35％左右。 ⑶肝素黃桿菌的透性化處理分別使用曲拉通X—100（Trit

6、on X—100）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、乙二胺四乙酸（EDTA）、吐溫80（Tween80）以及溶菌酶對肝素黃桿菌進行透性化處理，考查各種透性化試劑處理的操作復雜性和作用效果，確定透性化處理的條件為使用等體積的100 mg/L的溶菌酶于30℃處理30 min，制得的透性化肝素黃桿菌的肝素酶活性回收率達到50％以上；對酶活穩(wěn)定性的研究表明，透性化細胞的酶活穩(wěn)定性較粗酶液有較大提高，在最初5個批次的反

7、應過程中酶活性損失較明顯，從第6次反應開始酶活基本保持平穩(wěn)水平，經(jīng)過10次反應后，酶活保留40％以上。 ⑷透性化肝素黃桿菌的固定化使用海藻酸鈣包埋法對透性化肝素黃桿菌進行固定化，通過正交試驗確定固定化最佳條件為1．5％的海藻酸鈉、5％的CaCl2溶液，硬化20 h；對固定化細胞的最適溫度、溫度穩(wěn)定性、最適pH、pH穩(wěn)定性等理化性質(zhì)進行研究，確定了固定化細胞的最適溫度為30℃，最適pH為7．0。與粗酶液相比，固定化細胞的溫度穩(wěn)定性

8、有很大提高，最適溫度、最適pH的范圍有所擴大；在最佳條件下制備的固定化肝素黃桿菌的酶活回收率平均達到30％左右；固定化細胞的操作穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性相對于透性化細胞有很大提高，反應10次后酶活性保留60％以上，于4℃貯存120 h后酶活保留90％以上。 ⑸固定化肝素黃桿菌制備LMWH使用固定化肝素黃桿菌對肝素進行三個批次的不同時間的酶解作用，經(jīng)過超濾、濃縮及凍干后得到OH—1、OH—2和OH—3三組肝素寡糖樣品，對制得的肝素寡糖進

9、行190～350 nm波長范圍掃描，顯示在232 nm處有最大吸收；測定了三種肝素寡糖的部分理化性質(zhì)，使用多角度激光散射儀．高效凝膠滲透色譜聯(lián)用法（GPC—MALLS）測定肝素寡糖的分子量，三種肝素寡糖樣品的重均分子量分別為8798 D、6709 D和5671 D，分散度（polydispersity）分別為1．375、1．383和1．408；采用羊血漿法測定肝素寡糖的抗凝效價，COATEST Heparin試劑盒測定其抗FXa活性，三