柑橘屬常用中藥材陳皮、青皮次生代謝產(chǎn)物之揮發(fā)油成分研究.pdf

1、蕓香科 Rutaceae柑橘屬 Citrus L.植物藥用歷史悠久，許多常見中藥材如陳皮、青皮、枳實、枳殼、化橘紅、橘紅、橘葉、橘絡(luò)、橘核、佛手等均來自該屬植物。源于該屬的藥材在中藥性效、化學(xué)成分、藥理作用等方面既存在共性，又各具特征。代表性藥材陳皮 Citri Reticulatae Pericarpium(CRP)、青皮 Citri Reticulatae Pericarpium Viride(CRPV)即充分體現(xiàn)了這一特點。陳皮、

2、青皮同來源于柑橘屬柑橘 Citrus reticulata Blanco種及其變種，因不同的采收期而成為兩味中藥。陳皮為9～12月果實成熟時采摘的果皮；青皮為5～6月收集自落的幼果（個青皮），或7～8月采收的未成熟果實的果皮（四花青皮）。陳皮、青皮均為理氣藥，但臨床應(yīng)用和作用特點各有不同。陳皮的功效為理氣健脾，燥濕化痰；青皮的功效為疏肝破氣，消積化滯。陳皮長于理氣健脾，青皮長于疏肝破氣。陳皮作用部位主要在中上焦，青皮主要在中下焦。二者來

3、源相同，是體現(xiàn)中藥“一體二用”的代表?！耙惑w二用”是指來源于同一基原植物和同一入藥部位，因不同的生長期采收而成為功效、作用特點、臨床應(yīng)用不同的兩味中藥。陳皮和青皮因有相同的遺傳背景和次生代謝產(chǎn)物合成途徑，可將二者作為模式藥物進行中藥“一體二用”的研究。
　　陳皮、青皮的活性成分主要包括揮發(fā)油、黃酮成分。目前，關(guān)于陳皮、青皮的研究報道主要集中于黃酮類成分，而對具有較強生物活性的揮發(fā)油關(guān)注較少。已有的研究表明，揮發(fā)油是陳皮、青皮產(chǎn)生理

4、氣作用的主要部位。陳皮、青皮具有相同的性味，但其調(diào)氣作用有強弱之別，陳皮為理氣健脾，青皮為疏肝破氣?；诖耍瑥呐R床作用和化學(xué)成分的相關(guān)性考慮，理氣作用的強弱應(yīng)與其揮發(fā)油中所含主要成分含量有關(guān)；《中國藥典》2010版僅以橙皮苷一個成分作為陳皮、青皮藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)，并未將揮發(fā)油成分納入品質(zhì)評價體系，這不能全面的反映陳皮、青皮品質(zhì)；此外，由于柑橘揮發(fā)油優(yōu)良的芳香品質(zhì)及豐富的資源，它被認(rèn)為是制作食品、飲料、化妝品的主要香料來源。鑒于此，本文

5、對陳皮、青皮揮發(fā)油成分做了一較系統(tǒng)、全面、深入的研究。研究結(jié)果為揭示闡明“品種-成分-性效”相關(guān)性，中藥“一體二用”的科學(xué)內(nèi)涵奠定了一定的基礎(chǔ)；并對柑橘果皮的綜合利用，橘皮精油的產(chǎn)業(yè)化建設(shè)，促進地方經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義。
　　具體研究內(nèi)容及實驗結(jié)果如下：
　　1.陳皮、青皮揮發(fā)油提取、GC-MS分析方法學(xué)研究
　　1.1提取方法學(xué)研究
　　在實驗室已建立方法的基礎(chǔ)上，通過系統(tǒng)查閱文獻(xiàn)及實際操作，確定了一較好的提取

6、方案。目前國際上，對于新鮮柑橘果皮精油的提取主要采用壓榨法，因為這能充分地保障橘皮精油優(yōu)良的芳香品質(zhì)。但由于陳皮、青皮是以干燥的橘皮入藥，因此壓榨法并不適用于兩藥揮發(fā)油的提取?；诖耍狙芯咳圆捎媒?jīng)典的水蒸汽蒸餾提取法，具體方案如下：取粉碎后的樣品約10～30 g與約10倍量（V/W）蒸餾水（mL）于40℃時在一揮發(fā)油提取器(Clevenger-type apparatus)中溶脹1 h，隨后提取揮發(fā)油3～4 h，得無色或淡黃色澄明油狀

7、液體。提取完畢后，即讓揮發(fā)油在提取裝置中靜置1 h，后讀取揮發(fā)油的量（mL），并收集。揮發(fā)油于約5℃時通過無水硫酸鈉脫水24 h，后裝于具塞小瓶，置于冰箱中，以備氣相色譜-質(zhì)譜（Gas Chromatograph-Mass Spectrometer, GC-MS）分析所需。計算揮發(fā)油的收率（v/w）。結(jié)果表明該方法切實可行，提取效果較好。從各樣品揮發(fā)油得率看：廣陳皮的揮發(fā)油得率（3.56～8.71％）明顯高于其他陳皮、青皮（<0.7～4

8、.2%）。從實驗結(jié)果來看，為了確保有足夠的揮發(fā)油（≥0.1 mL）供分析用，應(yīng)當(dāng)確保樣品的量為：廣陳皮不少于10 g（貯藏年限較長的廣陳皮價格較高），其他陳皮、青皮不少于25 g，提取溶劑用量約為樣品量的10倍（V/W）。
　　1.2 GC-MS分析方法學(xué)研究
　　同樣地，在實驗室已有分析方法的基礎(chǔ)上，通過系統(tǒng)查閱文獻(xiàn)及實際操作，確定本研究中采取的方法為：Agilent7890A/5975C GC-MS氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（

9、美國），匹配一化學(xué)工作站MSD ChemStation E.02.01.1177，質(zhì)譜圖匹配的譜庫為NIST(National Institute of Standards and Technology，美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所)08 MS database。色譜柱HP-5MS5%Phenyl Methyl Siloxane(30 m×0.25 mm×0.25μm)。
　　柱箱升溫程序：初始溫度60℃，保持3 min，以4℃/min

10、的速率升至250℃。載氣為He，恒定流速1mL/min。進樣口（氣化溫度），離子源的溫度分別為280，230℃。分流比20:1。溶劑延遲：3.00 min。電離方式：EI(Electron impact)源；電子能量：70 eV；質(zhì)量范圍(m/z)：30～350 amu；掃描間隔：2.29 scans s-1。進樣前，樣品被稀釋為10%的n-hexane（正己烷）溶液。進樣量1μL。
　　通過本研究發(fā)現(xiàn)，以上參數(shù)還可進一步的優(yōu)化，

11、具體有：由于在藥材FCI-1-b，F(xiàn)CI-2-b，F(xiàn)CI-3-b揮發(fā)油中鑒定的化合物Pentacosane（正二十五烷）的分子量為352，超出了350的上限，因此恰當(dāng)?shù)馁|(zhì)量范圍(m/z)應(yīng)為：30～400 amu。
　　2中藥揮發(fā)油成分定性方法學(xué)研究——以陳皮、青皮為例
　　2.1中藥揮發(fā)油總離子流譜圖中重疊峰的拆分
　　中藥揮發(fā)油是一個十分復(fù)雜的體系，含有數(shù)以百計的化學(xué)成分，且許多成分性質(zhì)相近，這導(dǎo)致應(yīng)用 GC-MS

12、分析得到的總離子流譜圖(Total ion chromatogram, TIC)中存在著大量的重疊、甚至內(nèi)嵌峰。如何對這些重疊峰進行拆分，并定性，將對揮發(fā)油成分的正確分析起到至關(guān)重要的作用。本研究應(yīng)用氣-質(zhì)化學(xué)工作站(ChemStation)匹配的AMDIS(Automated Mass Spectral Deconvolution& Identification System,自動質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng))拆分中藥揮發(fā)油TIC中的重疊峰；并

13、首次系統(tǒng)、深入地闡述了如何應(yīng)用該程序拆分中藥揮發(fā)油TIC中的重疊峰（以陳皮、青皮為例）。該研究具有較好的創(chuàng)新性和實用性，對于解決色譜分析中色譜峰重疊問題具有很好的啟示作用。研究結(jié)果表明， AMDIS能初步分析TIC中含有多少化合物。而后，通過對各待鑒定化合物對應(yīng)掃描點提純譜圖及該掃描點原始譜圖與參考譜庫中各匹配化合物的比對、分析，確定其結(jié)構(gòu)；或否定某處提純譜圖及其對應(yīng)的化合物（即此提純譜圖并不合理，其對應(yīng)的化合物實際并不存在）。進一步，

14、通過選擇各化合物的特征性碎片離子峰，并分析它們的變化規(guī)律，可確認(rèn)已有的鑒定結(jié)果。尤其，當(dāng)被鑒定物濃度較低，且受到干擾時，AMDIS分析方法具有較大優(yōu)勢。它能有效去除干擾并獲得“純凈”的譜圖信息，從而增大目標(biāo)化合物定性的可靠性。不過，當(dāng)2個化合物的保留時間十分接近時，AMDIS有可能會漏檢?？傊珹MDIS的提純質(zhì)譜圖的功能，可有效地對重疊峰中混合質(zhì)譜圖進行拆分，進而準(zhǔn)確的對各物質(zhì)定性。
　　2.2 Kováts保留指數(shù)在中藥揮發(fā)油

15、成分定性中的作用
　　隨著GC-MS的普及，現(xiàn)在，對于中藥揮發(fā)油成分的定性主要通過MS完成。但是僅僅依靠MS對化合物定性是不夠的，因為許多萜烯類化合物有著基本相同的質(zhì)譜。因此對于補充質(zhì)譜數(shù)據(jù)而言，一些關(guān)于保留行為的知識是非常需要的。這其中最著名的就是Kováts于1958年提出的保留指數(shù)(Retention index, RI)概念。本研究應(yīng)用 Van den Dool與 Kratz提出的公式計算程序升溫保留指數(shù)(temperat

16、ure-programmed retention indices, ITP)。
　　研究結(jié)果表明，保留指數(shù)在中藥揮發(fā)油成分定性中發(fā)揮著重要作用，具有很大的參考價值。對于中藥揮發(fā)油成分的鑒定，應(yīng)將MS與保留指數(shù)結(jié)合起來，保留指數(shù)和其它手段綜合定性是氣相色譜發(fā)展的重要趨勢之一。
　　3中藥揮發(fā)油成分定量方法學(xué)研究——以陳皮、青皮為例
　　應(yīng)用2.2中的方法對TIC中的譜峰定性，定性后的色譜峰采用總體積積分和歸一化法進行定量

17、，并假定所有化合物的響應(yīng)因子均為1。盡管面積歸一化法是一較粗略的定量方法，但由于其操作簡便，因此本研究中仍采用此方法定量。對于TIC中的重疊峰，應(yīng)用AMDIS拆分定性后，通過各定性化合物的特征性碎片離子峰對各物質(zhì)進行一大致的峰面積定量。研究結(jié)果表明，此方法切實可行，數(shù)據(jù)可靠。
　　4同來源陳皮、青皮揮發(fā)油成分比較研究
　　由于陳皮、青皮的來源復(fù)雜，為了確保一個真正的比較研究，實驗中的藥材均首次采用了定種、定產(chǎn)地、定植株（1棵

18、或相鄰的幾顆）的方法進行收集。同時，實驗中各批次藥材的提取方法也相同。因此遺傳因素，生態(tài)環(huán)境，及技術(shù)參數(shù)的影響均被去除，一個真正的比較分析實驗得以進行。共對來源于2個變種：大紅袍（產(chǎn)地：重慶市璧山縣、四川夾江馬村）、椪柑（產(chǎn)地：四川蒲江）總計19批藥材進行了研究。
　　研究結(jié)果表明不同采收時間的陳皮、青皮（大紅袍、椪柑）揮發(fā)油成分在性質(zhì)、含量上均有一定的差異。并且源于不同變種的陳皮、青皮在揮發(fā)油大類成分上均呈現(xiàn)一致的變化規(guī)律：即隨

19、著采收時間的延長，單萜烯類成分的含量呈現(xiàn)先升高，再降低的趨勢；含氧化合物含量呈現(xiàn)先降低，再升高的趨勢。以揮發(fā)油成分含量為變量進行聚類分析，結(jié)果將不同采收期橘皮分為3類：早期采收的橘皮、中期采收的橘皮、晚期采收的橘皮，這與按采收期不同將橘皮分為個青皮、青皮、陳皮3類一致。
　　5不同貯藏年限廣陳皮（新會陳皮）揮發(fā)油成分對比研究
　　研究結(jié)果表明源于茶枝柑的不同貯藏年限的廣陳皮（新會陳皮）擁有幾乎相同的物質(zhì)基礎(chǔ)。直觀及聚類分析均

20、表明：貯藏期為4年的新會陳皮揮發(fā)油成分與其他5批貯藏年限更長的新會陳皮有較顯著性差異，后5批之間的差異性并不顯著。與4年新會陳皮相比，后5批廣陳皮總單萜烯類化合物含量有所升高，而總含氧化合物含量則降低。這表明，就揮發(fā)油類成分而言，陳皮確實需要“陳”，但這種“陳”也是有限度的，“陳”到一定程度即達(dá)到最佳。具體的變化趨勢和內(nèi)在規(guī)律還需要在今后的研究中做進一步探討。傳統(tǒng)認(rèn)為，陳皮在存放過程中，揮發(fā)性成分多已揮發(fā)，使得其他成分能更好地發(fā)揮藥理作

21、用。但本研究發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏年限的延長，揮發(fā)油的得率并未降低，這說明揮發(fā)油類成分仍是新會陳皮發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　6陳皮、青皮、橘皮揮發(fā)油化學(xué)型分析
　　Lota等根據(jù)化合物檸檬烯（Limonene）與γ-萜品烯（γ-Terpinene）的含量，將來源于不同柑橘變種果皮揮發(fā)油的化學(xué)型分為兩類：檸檬烯（83.8～96.2%）型與檸檬烯/γ-萜品烯（52.2～81.3%/11.2～36.7%）型。受 Lota的啟發(fā)，并在L

22、ota的基礎(chǔ)上，本研究首次系統(tǒng)分析了源于不同變種、不同產(chǎn)地陳皮、青皮（橘皮）揮發(fā)油的化學(xué)型。已有的研究結(jié)果表明，區(qū)分陳皮、青皮揮發(fā)油的化學(xué)型主要看4個物質(zhì)的含量高低，即：檸檬烯、γ-萜品烯、芳樟醇（Linalool）、2-甲氨基苯甲酸甲酯（Benzoic acid,2-(methylamino)-, methyl ester）。據(jù)此，本研究中來源于大紅袍、椪柑的陳皮、青皮（橘皮）揮發(fā)油歸屬于檸檬烯/芳樟醇型；源于茶枝柑的廣陳皮揮發(fā)油歸屬

23、于檸檬烯/γ-萜品烯/2-甲氨基苯甲酸甲酯化學(xué)型。
　　7揮發(fā)油成分在陳皮、青皮品質(zhì)評價中的作用
　　本研究表明，揮發(fā)油成分在陳皮、青皮品質(zhì)評價系統(tǒng)中具有重要作用。首先，同來源的陳皮、青皮揮發(fā)油成分具有顯著性差異，并且這種差異的總體特征在來源于不同變種、不同產(chǎn)地的陳皮、青皮均一致。直觀分析及聚類分析均表明：這種變化趨勢與傳統(tǒng)的按采收時間將橘皮分為個青皮、青皮、陳皮3種類型也是一致的。其次，就揮發(fā)油成分而言，陳皮中來源于茶枝柑

24、的道地藥材“廣陳皮”與其他陳皮、青皮具有顯著性差異。從化學(xué)型上來看，廣陳皮具有一特殊的化學(xué)型；另從揮發(fā)油在藥材中的含量來看，廣陳皮也明顯高于其他陳皮、青皮。因此可以推斷，廣陳皮之所以成為道地藥材，并顯現(xiàn)比其他陳皮更好的藥效，揮發(fā)油成分發(fā)揮了重要的作用。據(jù)此，建議《中國藥典》在今后的版本中將揮發(fā)油成分納入陳皮、青皮品質(zhì)評價體系，具體如下：化學(xué)型概念，得率，籍此將廣陳皮與其他陳皮區(qū)分；揮發(fā)油成分中兩大主成分（總單萜烯、總含氧化合物）的含量比