半胱天冬酶-8在腎癌中的表達及其臨床意義.pdf

1、目的：半胱天冬酶-8是否能在腎癌中表達并存在表達水平的改變。半胱天冬酶-8表達水平是否與腎癌的類型、病理分期、組織學分級及轉(zhuǎn)移相關聯(lián)。采用缺口末端標記法研究腎癌患者腎細胞凋亡情況并與Caspase-8表達作相關分析。通過從細胞凋亡的角度了解腎癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的途徑，有助于判斷腎癌的預后，有可能為腎癌的基因治療找到新的靶點。
　　 方法：
　　 研究對象分為：研究組、對照組。
　　 研究組：腎癌患者，40例。癌

2、旁組織，40例。
　　 對照組：正常腎組織，共10例。
　　 1、缺口末端標記法檢測細胞凋亡
　　 采用缺口末端標記法（TUNEL）原位標記凋亡細胞核，以PBS為陰性對照，按該試劑盒說明操作（武漢博士德生物工程有限公司）。每組觀察4孔（六孔板），每孔計數(shù)10個20×視野（每個視野計數(shù)至少200個細胞核，凋亡陽性細胞核呈棕黃色、非凋亡細胞核呈藍色）。根據(jù)公式（凋亡陽性細胞數(shù)/總細胞計數(shù)×100％）計算細胞凋亡指數(shù)（

3、apoptotic index，AI），取其均值。
　　 2、免疫組化sp法檢測Caspase-8表達
　　 試劑和方法：鼠抗人Caspase-8單克隆抗體（福建邁新生物技術公司），工作濃度1：100，sp免疫組化試劑盒（福建邁新生物技術公司），sp免疫組化染色按說明書進行，0.1mol/L，枸櫞酸鹽緩沖液熱修復抗原（98℃、5min）。
　　 結果判定：Caspase-8陽性判定：以0.1moI/LPBS替代-

4、抗體作為空白對照，用已知胃癌Caspase-8陽性表達片作為陽性對照，腎癌細胞漿或細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為Caspase-8染色陽性，參照Caide等的計數(shù)方法，400倍鏡下計數(shù)5個視野，陽性細胞率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100％，表達陽性程度：5％-25％為（+），26％-50％為（2+），51％-75％為（3+），>75％為（4+），切片中陽性細胞數(shù)≥5％為陽性表達，<5％為陰性表達。
　　 Caspase-8表達量：所有

5、免疫組化切片于實驗結束時由操作人員在單盲情況下于顯微鏡下觀察，以SECOM攝像頭將病理切片上的腎癌圖像采集入計算機，PIPS-2020超清晰彩色病理圖文系統(tǒng)行Caspase-8表達定量分析。計算公式如下：
　　 PU=100×（Ga-GA）/[（1-AAa）×Gmax]
　　 式中AAa=n/（n+m），Gmax為測試儀器最大灰度分級，n為陽性反應組織面積，m為背景面積，GA為平均灰度級，Ga為陽性反應組織灰度級。

6、>　　 結果：
　　 1、臨床資料
　　 40例研究對象，其中男性27例，女性13例，平均年齡53歲。透明細胞癌13例，乳頭狀細胞癌12例，混合癌8例，其他腎細胞癌（腎癌）7例。17例無癌轉(zhuǎn)移，22例有癌轉(zhuǎn)移。病理分期Ⅰ期11例，Ⅱ期12例，Ⅲ期10例，Ⅳ期7例。組織學分級為高分化13例，中分化17例，低分化10例。
　　 正常腎對照組10例，其中男性7例，女性3例，平均年齡50歲。
　　 病例組與對照

7、組以及各亞組年齡、性別無明顯統(tǒng)計學差異（p>0.05）。
　　 2、腎癌組織細胞凋亡情況研究
　　 采用缺口末端標記法檢測細胞凋亡，計算凋亡指數(shù)（AI）。腎癌組織Caspase-8表達陽性AI為7.5±2.3，Caspase-8表達陰性AI為3.8±1.6，腎癌組織Caspase-8表達陽性者AI明顯高于Caspase-8表達陰性者，經(jīng)統(tǒng)計學處理（T檢驗），P<0.01。提示腎癌組織存在細胞凋亡異常。
　　 3、

8、腎組織細胞caspase-8表達研究
　　 采用免疫組化sp法檢測Caspase-8表達，發(fā)現(xiàn)腎癌患者癌組織、癌旁組織、正常腎組織細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)有棕黃色顆粒，呈彌漫分布，呈Caspase-8陽性表達，提示正常細胞與癌組織細胞均能表達caspase-8。
　　 正常腎組織（對照組），癌旁組織和腎癌中caspase-8的陽性表達率分別為100％（10/10），100％（40/40），90％（36/40），經(jīng)x2檢驗，正常腎

9、組織（對照組）和癌旁組織與腎癌組織caspase-8表達的陽性率無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 腎癌中caspase-8的表達強度2例4+，4例3+，14例2+，16例1+，4例（-）。癌旁組織中caspase-8的表達強度：1例4+，19例3+，14例2+，6例1+。正常腎組織（對照組）caspase-8的表達強度：7例4+，3例3+。三組的caspase-8的表達強度經(jīng)統(tǒng)計學秩和檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（Friedman

10、X2=51.61，P<0.01），兩兩之間的秩和檢驗，caspase-8的表達強度正常腎組織最高，癌旁組織次之，癌組織最低（P<0.01）。
　　 Caspase-8表達量，正常腎組織為27.02±6.48，癌旁組織15.74±4.02，癌組織10.81±7.67，caspase-8的表達量正常腎組織最高，癌旁組織次之，癌組織最低，經(jīng)F檢驗，F(xiàn)=81.65，P<0.01。兩兩之間的q檢驗，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。提示

11、腎癌組織存在Caspase-8表達改變。
　　 4、不同腎癌類型、病理分期、組織學分級及轉(zhuǎn)移情況caspase-8表達研究
　　 透明細胞癌，乳頭狀細胞癌（嗜色細胞，顆粒細胞癌），混合癌，其他腎細胞癌，四個類型caspase-8表達強度的比較通過統(tǒng)計學kruskal-wallis秩和檢驗（kruskal-wallis x2=0.44，P>0.05）差異無統(tǒng)計學意義，提示caspase-8表達與腎癌類型無明顯關聯(lián)。

12、　　 腎癌的病理分期與caspase-8表達強度經(jīng)統(tǒng)計學spearman等級相關分析得出相關系數(shù)r=-0.60，有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。提示腎癌病理分期越高，caspase-8表達越低。
　　 腎癌的組織學分級與caspase-8表達強度經(jīng)統(tǒng)計學spearman等級相關分析得出相關系數(shù)r=-0.60，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示腎癌組織學分級越低，caspase-8表達率越低。
　　 22例轉(zhuǎn)移腎癌的c

13、aspase-8表達強度為：2例2+，16例+，4例-；17例未轉(zhuǎn)移腎癌的caspase-8表達強度為：2例4+，4例3+，11例2+。兩組caspase-8表達強度的比較通過統(tǒng)計學wilcoxon秩和檢驗（Z=3.46，P<0.01）差異有高度統(tǒng)計學意義。提示caspase-8表達與腎癌轉(zhuǎn)移相關聯(lián)，有轉(zhuǎn)移者caspase-8表達強度低于未轉(zhuǎn)移的。
　　 5、腎癌組織凋亡指數(shù)與Caspase-8表達的相關研究
　　 通過

14、spearman的相關分析得出凋亡指數(shù)與Caspase-8的相關系數(shù)為0.36461（p<0.05）。提示凋亡指數(shù)與caspase-8的表達量成正相關，腎癌組織的凋亡指數(shù)低，caspase-8的表達量也低。
　　 結論：
　　 1、caspase-8能在腎癌、癌旁組織與正常腎細胞中表達。
　　 2、與正常腎細胞比較，腎癌組織、癌旁組織caspase-8的表達下調(diào)，尤以腎癌組織明顯。
　　 3、腎癌惡性程度

15、越大，caspase-8表達下調(diào)越明顯。
　　 4、與非轉(zhuǎn)移腎癌比較，轉(zhuǎn)移腎癌caspase-8表達明顯下調(diào)。
　　 5、caspase-8表達與不同腎癌類型無明顯相關聯(lián)。
　　 6、不同腎癌病理分期caspase-8的表達存在差異，病理分期越低，caspase-8表達越高。
　　 7、腎癌組織存在細胞凋亡異常，腎癌組織Caspase-8表達陽性者AI明顯高于Caspase-8表達陰性者，凋亡指數(shù)與cas