Ezrin在腎癌中表達(dá)的臨床意義及其對腎癌生物學(xué)性狀影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的： 腎癌是泌尿系最常見的腫瘤之一，在泌尿系腫瘤中位居第二，具有組織多樣性，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，腎癌惡性程度高，不易早期發(fā)現(xiàn)，確診時約35%的患者已有轉(zhuǎn)移，2年死亡率高達(dá)95%，約40%患者術(shù)后轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，3年存活率小于5%.腎癌一旦出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移，即使行根治性淋巴結(jié)清掃，患者生存期也極少超過5年，由于腎癌先天性對放療、化療都不敏感，放療、化療不作為常規(guī)輔助治療。近年來晚期腎癌的生物治療，靶向治療取得了一定的成績，但療效仍很

2、有限，有待進(jìn)一步提高。隨著診斷手段，外科技術(shù)的日臻完善，腎癌的預(yù)后有一定的改善，但復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移仍是威脅患者生命的主要因素，因此轉(zhuǎn)移性腎癌的防治是目前研究工作的重點(diǎn)，熱點(diǎn)，迫切需要尋找新的治療方案。 研究目的：1.從蛋白和基因水平觀察人腎癌組織中ezrin的表達(dá)及其與腎癌臨床病理特征的關(guān)系；2.構(gòu)建人ezrin基因短發(fā)夾狀小干擾RAN的質(zhì)粒載體，采用RNA干擾技術(shù)沉默人腎癌細(xì)胞系786-0細(xì)胞中ezrin基因表達(dá)，觀察干擾前后786

3、-0細(xì)胞生物學(xué)性狀改變，一方面進(jìn)一步明確ezrin在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用，另一方面探討利用RNA干擾技術(shù)作為腎癌基因治療的策略和方法。 材料和方法： 一膜細(xì)胞骨架蛋白-ezrin在人腎癌組織中表達(dá)及其臨床意義。 1.對80例腎癌組織和40例癌旁正常腎組織行組織芯片制作及免疫組化染色檢測；結(jié)果判斷：ezrin陽性表達(dá)在腎癌細(xì)胞膜和胞漿內(nèi)，呈棕黃色顆粒；半定量分析：組織切片免疫組化染色評估由同一位病理醫(yī)師完成，按染色

4、強(qiáng)度和陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，按照參考文的評分標(biāo)準(zhǔn)，對每張切片進(jìn)行評分，無染色：0分，染色較弱：1分，中等強(qiáng)度：2分，強(qiáng)染色：3分；按每個視野中陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評分，未見陽性細(xì)胞：0分，陽性細(xì)胞1%～24%：1分，陽性細(xì)胞25%～49%：2分，陽性細(xì)胞50%～74%：3分，陽性細(xì)胞超過75%：4分。以上兩種評分相乘為最終分?jǐn)?shù)，按本評分系統(tǒng)，最高分為12，最低為零。 2.根據(jù)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腔靜脈瘤栓形成分為：單純腎癌組織（無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，無

5、腔靜脈瘤栓形成），癌旁正常腎組織，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腎癌組織，伴有腔靜脈瘤栓形成腎癌組織。每組隨機(jī)取10例行RT-PCR和Western blot測定各組ezrin mRNA及ezrin蛋白相對表達(dá)量。 二.人ezrin基因短發(fā)夾狀RNA質(zhì)粒載體構(gòu)建、制備及篩選。 1.短發(fā)夾狀小干擾RNA的模板寡核苷酸鏈的設(shè)計與合成：從gene bank中搜索ezrin基因序列（NM_003379.4 GI：161702984）應(yīng)用Ambi

6、on在線RNAi設(shè)計軟件，設(shè)計2對siRNA s（small interference RNAs），確定并合成兩端分別帶有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)shRNAs（short hairpin RNAs）單鏈，退火復(fù)性合成雙鏈，BamHⅠ和HindⅢ酶切載體pGenesil-1，連接退火復(fù)性產(chǎn)物，酶切后載體內(nèi)含不同ezrin基因特異性序列的寡核苷酸干擾片斷（shRNA-ezrin1，shRNA-ezrin2），另設(shè)計通用陰性pGenes

7、il-1-HK。 2.重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定和測序分析，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌及大量質(zhì)粒提取。 3.shRNA功能鑒定：常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，待人腎癌細(xì)胞系786-0細(xì)胞達(dá)80-100%融合時，進(jìn)行傳代，傳至第三代時用脂質(zhì)體lipofectamin TM2000轉(zhuǎn)染；786-0細(xì)胞分別用兩個重組質(zhì)粒，陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，另設(shè)未轉(zhuǎn)染組為空白對照，即分別為：shRNA-ezrin1，shRNA-ezrin2，shRNA-HK，blank組

8、；于轉(zhuǎn)染后24h在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，根據(jù)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein GFP）表達(dá)后發(fā)綠色熒光的特征，在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，計算出質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率=每高倍鏡視野發(fā)熒光細(xì)胞數(shù)／同一視野細(xì)胞總數(shù)×100%。 三.RNA干擾技術(shù)抑制ezrin表達(dá)對人腎癌細(xì)胞系786-0細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲性的影響。 1.shRNA干擾效率的檢測：①實(shí)驗(yàn)分組：未轉(zhuǎn)染組（bl

9、ank）、陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（HK）、shRNA-ezrin1轉(zhuǎn)染組、shRNA-ezrin2轉(zhuǎn)染組；以每孔200ul（5×103）個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。②運(yùn)用熒光定量PCR檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48小時各組ezrin mRNA表達(dá)；用相對定量數(shù)據(jù)分析：以2-△△Ct（Ct代表循環(huán)閾值）表示基因的表達(dá)量，平均相對含量=2-average△△CT×100%，干擾效率=（1-

10、2-average△△CT）×100%，公式：△△Ct={Ct（ezrin）-Ct（β-actin））干擾細(xì)胞-{Ct（ezrin）-Ct（β-actin）}對照（未轉(zhuǎn)染細(xì)胞）。③Western Blot檢測ezrin蛋白的表達(dá)，分別檢測轉(zhuǎn)染后24h和72h各組ezrin蛋白相對含量。 2.MTT檢測細(xì)胞增殖活性：分別于轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5、6、7天時收集各組細(xì)胞，每組6孔；在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的光吸收值（A值），比較

11、各組細(xì)胞的增殖情況。 3.透射電鏡檢測786-0細(xì)胞凋亡：收集轉(zhuǎn)染后72h shRNA-ezrin1轉(zhuǎn)染組786-6細(xì)胞和對照組細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染），按照投射電鏡制片步驟制片，最后在不同倍數(shù)下用JEM-2000EX投射電鏡觀察轉(zhuǎn)染前后人腎癌細(xì)胞系786-0細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 4.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞增殖周期：以亞G1峰的細(xì)胞數(shù)占觀察細(xì)胞分?jǐn)?shù)為細(xì)胞凋亡的檢測指標(biāo)，細(xì)胞增殖指數(shù)（PI proliferation index）為

12、PI=[S+G2/M]／[G0/G1+S+G2/M]。 5.細(xì)胞同質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)：觀察RNAi干擾ezrin表達(dá)對人腎癌細(xì)胞系786-0細(xì)胞粘附性的改變。 6.趨化運(yùn)動實(shí)驗(yàn)：觀察RNAi干擾ezrin表達(dá)對人腎癌細(xì)胞系786-0細(xì)胞運(yùn)動及穿孔能力的影響。 7.軟瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)：觀察RNAi干擾ezrin表達(dá)對人腎癌細(xì)胞系786-0細(xì)胞錨著獨(dú)立生長能力的影響。 結(jié)果： 1.ezrin蛋白的表達(dá)定位于

13、胞漿和胞膜，ezrin蛋白陽性表達(dá)率腎癌組織中為95%（76/80），高于癌旁正常腎組織75%（30/40）。 2.各組ezrin mRNA均有表達(dá)，且組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 3.Western Blot檢測結(jié)果表明：ezrin蛋白表達(dá)各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 4.經(jīng)酶切鑒定分析，質(zhì)粒p-shRNA-ezrin1，p-shRNA-ezrin2均符合設(shè)計要求。 5.重組質(zhì)粒的測序分析：DNA測序結(jié)果顯示插入

14、片斷與設(shè)計DNA片斷完全一致。 6.轉(zhuǎn)染效率測定。 7.熒光定量PCR結(jié)果表明：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后，各組中均有不同程度的ezrin基因擴(kuò)增，溶解曲線未見有雜峰。 8.Western Blot分析顯示：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h后各組間ezrin蛋白的相對表達(dá)量無顯著性差異。 9.RNA干擾對786-0細(xì)胞生物學(xué)行為影響 結(jié)論： 1.膜細(xì)胞骨架蛋白-ezrin在人腎細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，表達(dá)水平明顯高于癌旁

15、正常腎組織。 2.ezrin蛋白在腎癌中表達(dá)程度與患者年齡、性別、臨床病理分期、分級及病理分型及腫瘤大小無關(guān)，與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否有腔靜脈瘤栓形成密切相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腔靜脈瘤栓形成的腎癌組織顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腔靜脈瘤栓形成的腎癌組織。 3.選擇ezrin基因編碼區(qū)序列，運(yùn)用含U6啟動子的轉(zhuǎn)錄載體p-genesil-1成功的構(gòu)建了兩條具有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小干擾RNA重組質(zhì)粒。 4.在體外重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人腎癌細(xì)胞

16、系786-0細(xì)胞，經(jīng)熒光定量PCR和Western Blot檢測，兩條重組質(zhì)粒載體能有效抑制786-0細(xì)胞中ezrin mRNA和蛋白表達(dá)，兩條shRNA干擾效率分別66.55%和52.37%。 5.選用抑制效率較高的一條（基因位點(diǎn)344-363）轉(zhuǎn)染人腎癌細(xì)胞系786-0細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)shRNA干擾后786-0細(xì)胞增殖活性減弱，G0/G1期細(xì)胞數(shù)比率增加，細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞粘附能力和侵襲力減弱。 6.膜細(xì)胞骨架蛋白-ez