子宮內膜癌組織中DACH1基因啟動子的甲基化狀態(tài)及其臨床意義.pdf

1、研究背景:
　　 子宮內膜癌(endometrial carcinoma，EC)是女性生殖器官中常見的三大惡性腫瘤之一，其約占女性生殖道惡性腫瘤的20％-30％，近年來子宮內膜癌在世界范圍內其發(fā)病率和病死率呈上升趨勢，2008年全球新發(fā)子宮內膜癌1880000，410000女性死于子宮內膜癌，甚至在部分發(fā)達國家，子宮內膜癌成為婦科惡性腫瘤的首位，嚴重危害女性健康。美國每年有約4萬例新發(fā)子宮內膜癌病例，2011年新發(fā)子宮內膜癌更增

2、至46470例，有8120例死于子宮內膜癌。我國子宮內膜癌發(fā)病率也呈逐年升高趨勢，己接近甚至超過宮頸癌的發(fā)病率。根據(jù)其與雌激素的關系分為Ⅰ型（雌激素依賴型）和Ⅱ型（非雌激素依賴型）。Ⅰ型子宮內膜癌癌細胞分化好，雌、孕激素受體表達陽性，預后較好;Ⅱ型子宮內膜癌，惡性程度高，預后差，雌、孕激素受體不表達或弱表達。盡管同卵巢癌、宮頸癌相比，子宮內膜癌的預后較其他生殖器官惡性腫瘤要好，但是子宮內膜癌的5年生存率并不令人滿意，子宮內膜癌的5年生存

3、率在Ⅰ～Ⅱ期為83％，在Ⅲ期5年生存率73％，Ⅳ期5年生存率約為62％。
　　 近年來，隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子生物學研究的不斷深入，人們逐漸認識到表觀遺傳學在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用。表觀遺傳學修飾主要表現(xiàn)形式有:DNA甲基化(DNA methyaltion)、組蛋白修飾(histone modification)、染色體重塑(chromatin remodeling)和小RNA(mi croRNA)調控等。這些表觀修飾在不改

4、變DNA堿基序列的前提下調控基因的表達而在細胞中形成獨特的表型，影響細胞基因的表達，并將此影響隨細胞分裂而遺傳下去。因此表觀修飾是一類高于基因水平的基因調控機制，是將基因型與表型聯(lián)系起來的紐帶。其中DNA甲基化是基因主要的表觀遺傳修飾形式，目前通過對抑癌基因啟動子區(qū)CpG島的過度甲基化研究，認為抑癌基因啟動子區(qū)CpG島的過度甲基化是抑癌基因失活的一個重要機制。
　　 DACH1(Cell fate determination f

5、actor Dachshund DACH1)是Hammond在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的與果蠅dac基因同源的基因，dac基因是果蠅視網(wǎng)膜決定（retinal determination，RD）信號通路（包括ey/Pax6、So/Six、eya/Eya等）的主要成員，dac基因能單獨誘導果蠅異位眼的形成，且對細胞分化方向起決定作用。研究發(fā)現(xiàn)，DACH1蛋白在乳腺癌、前列腺癌、子宮內膜癌中表達缺失或低表達，提示DACH1基因可能是一種新的抑癌基因。

6、
　　 本研究通過檢測DACH1基因啟動子在子宮內膜癌細胞系、子宮內膜癌、正常子宮內膜組織中的甲基化狀態(tài)，比較DACH1蛋白在子宮內膜癌細胞系及子宮內膜癌、正常子宮內膜組織中的表達的差異，分析DACH1蛋白的表達與DACH1基因啟動子甲基化之間表達的相關性。并探討DACH1基因啟動子甲基化與子宮內膜癌臨床、病理特征間的關系，分析DACH1基因啟動子的甲基化在子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用，從而為子宮內膜癌的診斷、治療及預后判斷提供新

7、的依據(jù)。
　　 第一部分不同子宮內膜癌細胞系中DACH1基因啟動子甲基化的狀態(tài)及其與DACH1蛋白表達的關系
　　 目的:
　　 檢測不同子宮內膜癌細胞系Ishikawa，ECC-1，SPEC-2，HEC-1-A, KLE中DACH1基因啟動子甲基化的差異。探討DACH1基因啟動子甲基化與不同類型子宮內膜癌發(fā)生、發(fā)展的關系。
　　 材料與方法:
　　 1.子宮內膜癌細胞系Ishikawa，SPEC

8、-2為本實驗室所存，子宮內膜癌細胞系KLE，ECC-1，HEC-1-A由王晨光教授惠贈。
　　 采用甲基化特異性PCR(MSP)法檢測子宮內膜癌細胞系Ishikawa，ECC-1，SPEC-2，HEC-1-A，KLE中DACH1基因啟動子甲基化狀態(tài)。
　　 2.采用Westernblot法檢測子宮內膜癌細胞系Ishikawa，ECC-1，SPEC-2，HEC-1-A，KLE中DACH1蛋白的表達，DACH1蛋白表達陽性的

9、Hela細胞作為該實驗的陽性對照。分析DACH1蛋白的表達與DACH(I)基因啟動子甲基化之間表達的相關性。
　　 結果:
　　 一、子宮內膜癌細胞系中高分化子宮內膜腺癌細胞系Ishikawa，ECC-1未檢測到DACH1基因啟動子甲基化產(chǎn)物，中分化子宮內膜腺癌細胞系HEC-1-A、低分化子宮內膜腺癌細胞系KLE中DACH1基因啟動子甲基化陽性，漿液性腺癌子宮內膜癌細胞系SPEC-2中DACH1基因啟動子甲基化陽性。

10、r>　　 二、DACH1蛋白在子宮內膜癌細胞系Ishikawa，ECC-1，SPEC-2，HEC-1-A，KLE中均有表達，但在低分化子宮內膜癌KLE、漿液性腺癌內膜癌細胞系SPEC-2中表達較弱。
　　 結論:
　　 1.不同子宮內膜癌細胞系中DACH1基因啟動子甲基化存在差異，DACH1基因啟動子的甲基化狀態(tài)在人類子宮內膜癌特別是低分化子宮內膜癌及Ⅱ型子宮內膜癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制中起著重要的作用。
　　

11、2.DACH1蛋白在子宮內膜癌細胞系SPEC-2、KLE中的低表達與DACH1基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)有關。
　　 第二部分子宮內膜癌DACH1基因啟動子甲基化及其與患者臨床病理特征的關系
　　 目的：
　　 探討子宮內膜癌組織中DACHl基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及其與子宮內膜癌臨床病理特征之間的關系。
　　 方法：
　　 1.選取山東大學齊魯醫(yī)院及山東大學第二醫(yī)院2004年2月-2008年

12、8月經(jīng)病理檢查證實的子宮內膜癌患者80例,行全面分期手術,取其新鮮癌組織,部分組織用10％甲醛固定,石蠟包埋,連續(xù)切片,其中1張行HE染色復診,部分組織放-70℃冰箱冷凍備用。患者年齡31-72歲,平均54.6歲；按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO,2000)提出的內膜樣癌組織3級分類法,該80例子宮內膜癌組織標本中病理學分級為G1級的有21例,占26.25%,病理學分級為G2級的有18例,占22.50%,病理學分級為G3級有41例,占51.

13、25%。手術病理分期：Ⅰ期患者51例,占63.75%,Ⅱ期患者15例,占18.75%,Ⅲ期患者11例,占13.75%,Ⅳ期患者3例,占3.75%。按病理類型分類,子宮內膜樣腺癌共53例,占66.25%,漿液性乳頭狀腺癌共16例,占20%,透明細胞癌共11例,占13.75%。80例標本中子宮肌層浸潤≤1/2者61例,占76.25%,子宮肌層浸潤1/2的患者共19例,占23.75%。淋巴結轉移者14例,占17.5%,無淋巴結轉移66例,占8

14、2.5%。
　　 采用甲基化特異性PCR (MSP)法檢測子宮內膜癌組織及正常子宮內膜組織中DACH1基因啟動子的甲基化狀態(tài),并分析DACH1基因啟動子甲基化與子宮內膜癌手術病理分期、組織病理學分級、肌層浸潤程度、淋巴結轉移、病理學類型、年齡等臨床病理學參數(shù)的關系,探討DACH1基因啟動子甲基化與子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展的關系。DACH1基因啟動子甲基化在不同組織中陽性率的比較,及其表達與各臨床病理指標之間關系的比較采用x2檢驗和校正

15、x2檢驗。
　　 2.選取同期(2008年)因功能失調性子宮出血行診斷性刮宮患者病理證實為正常子宮內膜組織20例作為對照。采用Western法檢測80例子宮內膜癌子宮內膜組織和正常子宮內膜組織20例中DACH1蛋白的表達,DACH1蛋白表達陽性的Hela細胞作為該實驗的陽性對照。比較DACH1蛋白在各種組織中的表達的差異,分析DACH1蛋白的表達與DACH1基因啟動子甲基化之間表達的相關性。
　　 結果：
　　

16、一、80份子宮內膜癌組織中,24份組織DACH1基因啟動子甲基化陽性,其甲基化率為30%(24/80)；20份正常子宮內膜組織中,僅1份組織DACH1基因啟動子甲基化陽性,其甲基化率為5%(1/20),兩者甲基化率比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。
　　 二、子宮內膜癌組織中,DACH1基因啟動子的甲基化狀態(tài)與病理分級、病理類型有關,G1-G2癌組織中DACH1基因啟動子的甲基化率為18%(7/39),顯著低于G3者(41%

17、,17/41),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；子宮內膜樣腺癌組織中DACH1基因啟動子的甲基化率為23%(12/53),顯著低于特殊類型子宮內膜癌(44%,12/27),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。而DACH1基因啟動子的甲基化狀態(tài)與患者年齡、手術病理分期、肌層浸潤深度及淋巴結轉移無關(P0.05)。
　　 三、在DACH1基因啟動子呈甲基化狀態(tài)的子宮內膜癌組織中DACH1蛋白呈現(xiàn)不表達或者低表達狀態(tài),而在DACH1基因啟

18、動子呈未甲基化狀態(tài)的子宮內膜癌組織和正常子宮內膜組織中DACH1蛋白呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。24例子宮內膜癌組織樣本DACH1的表達水平與DACH1啟動子區(qū)甲基化程度進行相關性分析,發(fā)現(xiàn)二者之間存在負相關(r=-0.30,P0.05)。
　　 結論：
　　 1.低級別的子宮內膜癌中DACH1基因啟動子的甲基化率高,提示DACH1基因啟動子的甲基化可能與患者的不良預后有關。
　　 2. DACH1基因啟動子的高甲基化狀態(tài)在