NGAL在呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷小鼠模型中表達(dá)的研究.pdf

1、研究背景：機(jī)械通氣具有生命支持的作用，但它也能導(dǎo)致嚴(yán)重的肺損傷?！吧飩笔瞧湟粋€(gè)重要的發(fā)生機(jī)制，炎癥和天然免疫反應(yīng)在其中具有重要的作用。呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷（VALI）的生物標(biāo)記物具有早期診斷和判斷疾病預(yù)后的重要作用，并為探索VALI的發(fā)生機(jī)制提供新的切入點(diǎn)。目前文獻(xiàn)報(bào)道的與VALI相關(guān)的生物標(biāo)記物幾乎是參與炎癥和免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中的關(guān)鍵分子，但是它們?cè)赩ALI中的確切作用還未明確。并且目前還缺乏特異性和敏感性強(qiáng)，利于早期診斷和治療的生物標(biāo)

2、記物。尋找新的、特異性和敏感性強(qiáng)的生物標(biāo)記物是目前研究的重點(diǎn)。中性粒細(xì)胞（PMN）在VALI的發(fā)生過(guò)程中具有重要的作用，幾乎參與了整個(gè)VALI的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，在持續(xù)性肺損傷的正反饋環(huán)中處于中心地位。因此PMN或是其調(diào)節(jié)通路中的關(guān)鍵分子可以作為VALI生物標(biāo)記物的重點(diǎn)候選分子。中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）主要由中性粒細(xì)胞分泌，也能由肺泡上皮細(xì)胞分泌，它在體內(nèi)如何調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的功能還不清楚，它是否參與VALI的發(fā)病過(guò)程文獻(xiàn)報(bào)

3、道鮮見(jiàn)。NGAL能反映PMN激活狀態(tài)并廣泛參與了炎癥和免疫反應(yīng)；它還是一種急性期反應(yīng)蛋白和分泌蛋白，易于在血清和肺泡灌洗液中檢測(cè)到。因此，鑒于上述NGAL具有作為生物標(biāo)記物的這些生物學(xué)特性,我們?cè)O(shè)想NGAL可作為VALI生物標(biāo)記物的深入研究的重要靶標(biāo)，它可能作為機(jī)械力和炎癥刺激的感受器參與了VALI的發(fā)病機(jī)制。
　　 目的：采用不同的機(jī)械通氣策略作用于小鼠的健康肺和已有損傷的肺，構(gòu)建不同的急性肺損傷模型。觀察NGAL在小鼠VIL

4、I模型中不同機(jī)械通氣策略對(duì)其表達(dá)的影響，希望能證實(shí)NGAL是VALI新的生物標(biāo)記物的設(shè)想，為識(shí)別VALI高危病人提供有力工具。
　　 研究?jī)?nèi)容和方法：
　　 第一部分：分別以低吸氣末峰壓（PIP=15cmH2O2，PEEP=0 cmH2O2）、高吸氣末峰壓（PIP=50cmH2O，PEEP=2.5cmH2O）、大潮氣量（Vt=30ml/kg，PEEP=0cmH2O）和小潮氣量（Vt=6ml/kg，PEEP=5cmH2O）

5、給與健康雄性C57BL/6小鼠通氣2h，利用半定量RT-PCR、實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法觀察小鼠肺組織NGAL、MMP-9和IL-1βmRNA的變化；利用Western blot的方法檢測(cè)NGAL蛋白在肺組織、血清和BAL中的變化；利用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清和BAL中MMP-9和IL-1β蛋白水平的變化，觀察不同通氣策略對(duì)NGAL、MMP-9和IL-1βmRNA和蛋白表達(dá)的影響。并采用免疫組化的方法檢測(cè)NGAL蛋白在損傷

6、性通氣肺組織中的空間定位。
　　 第二部分：分別以大潮氣量（Vt=30ml/kg，PEEP=0cmH2O）和小潮氣量（Vt=6ml/kg，PEEP=5cmH2O）給與健康小鼠通氣2h和4h，觀察不同通氣時(shí)相對(duì)NGAL、MMP-9和IL-1βmRNA和蛋白表達(dá)的變化（檢測(cè)方法同上）。
　　 第三部分：小鼠氣管內(nèi)分別滴入2.5mg/kg和5.0 mg/kg LPS，24h后以大潮氣量（Vt=30ml/kg，PEEP=0cmH

7、2O）和小潮氣量（Vt=6ml/kg，PEEP=5cmH2O）給與通氣2h，觀察不同通氣策略對(duì)LPS預(yù)處理小鼠肺組織NGAL、MMP-9和IL-1βmRNA和蛋白表達(dá)的影響（檢測(cè)方法同上）。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分：不同的通氣策略都能引起小鼠NGAL的表達(dá)升高，在損傷性通氣策略組升高顯著，高吸氣末峰壓組和大潮氣量通氣組NGAL mRNA比對(duì)照組分別升高了41.9和3.29倍，BAL中NGAL蛋白水平上升了4倍和1.

8、8倍，血清和肺組織中蛋白也有不同程度的上升。并且在肺組織的上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞表達(dá)，提示NGAL是對(duì)機(jī)械刺激敏感的傳感蛋白，它可能參與了VILI的發(fā)病機(jī)制。MMP-9和IL-1β在大潮氣量通氣組的表達(dá)也明顯上升，與NGAL的表達(dá)變化趨勢(shì)相同。
　　 第二部分：在大潮氣量組，隨著通氣時(shí)間的延長(zhǎng)，NGAL在2h表達(dá)量較0h增加了3.29倍，在4h即迅速增加到8.75倍，蛋白的表達(dá)量也與損傷性通氣時(shí)間成正相關(guān)。而在

9、小潮氣量組，NGAL的表達(dá)沒(méi)有隨通氣時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生變化，維持在較低的水平，提示NGAL是監(jiān)測(cè)VALI發(fā)生的有力指標(biāo)。
　　 第三部分：小鼠單獨(dú)氣管內(nèi)滴注LPS后能引起NGAL的表達(dá)升高。給與LPS預(yù)處理小鼠小潮氣量通氣后，NGAL的表達(dá)顯著上升，明顯高于單獨(dú)LPS處理和單獨(dú)機(jī)械通氣組，mRNA增加了119.45倍，蛋白升高了6.1倍。MMP-9和IL-1β在BAL和血清中的水平也顯著增高，提示LPS和機(jī)械通氣具有協(xié)同刺激NGAL

10、表達(dá)和釋放的作用，非損傷性機(jī)械通氣策略聯(lián)合LPS就能導(dǎo)致肺損傷的形成。
　　 結(jié)論：
　　 1.不同的通氣策略都能引起小鼠NGAL的表達(dá)升高，在損傷性通氣策略中升高更明顯。
　　 2．在大潮氣量通氣策略下NGAL的表達(dá)與損傷性通氣時(shí)間成正相關(guān)。
　　 3．LPS也能上調(diào)NGAL的表達(dá)，LPS和機(jī)械通氣具有刺激NGAL表達(dá)和釋放的協(xié)同作用。
　　 4．NGAL可以作為早期判斷VALI潛在的，新的生物