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文檔簡介
1、目的:原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性疾病,以其強(qiáng)烈的侵襲性和轉(zhuǎn)移性、極短的存活率使之迅速竄升我國惡性腫瘤死亡率的第二位。由于肝癌發(fā)病的隱匿性,絕大部分患者在就診時已處于臨床晚期,無法進(jìn)行手術(shù)根除治療,且由于荷瘤機(jī)體內(nèi)T輔助淋巴細(xì)胞(Helper T Cells,Th)分化失衡、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)數(shù)量減少及功能缺陷,機(jī)體抗腫瘤
2、免疫無能或低下、化療效果及預(yù)后均差。文獻(xiàn)報道,機(jī)體的免疫能力對惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著重要的調(diào)控作用,免疫療法已成為當(dāng)今抗癌治療的重中之重,如何提高荷瘤機(jī)體抗腫瘤免疫力成為目前肝癌治療的核心問題,基于中藥多糖在預(yù)防肝癌發(fā)生及減少復(fù)發(fā),拮抗放、化療的毒副作用,增強(qiáng)免疫力延長生存期等方面的優(yōu)勢,臨床上聯(lián)合中藥多糖治療肝癌的應(yīng)用也越來越廣泛。枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides,LBP)是中藥枸杞子發(fā)揮抗腫
3、瘤作用的關(guān)鍵成分,大量藥理實驗研究表明LBP對荷瘤機(jī)體產(chǎn)生顯著的免疫調(diào)節(jié)作用(如調(diào)節(jié)荷瘤機(jī)體多種免疫效應(yīng)細(xì)胞:T細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞活性以及誘生多種抗癌細(xì)胞因子的功能),從而抑制腫瘤生長,但其作用于腫瘤的具體分子及免疫學(xué)機(jī)制尚未清楚。文獻(xiàn)報道CXC趨化因子配體10(C chemokine ligand10 XCL10)可以趨化T細(xì)胞、單核細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞至腫瘤發(fā)生部位殺死腫瘤細(xì)胞,并且CXCL10的表達(dá)與肝
4、炎、肝硬化、肝癌等肝臟疾病關(guān)系尤為密切,枸杞多糖聯(lián)合細(xì)胞因子CXCL10治療肝癌是一次嶄新的嘗試,本實驗組在前期課題組的研究基礎(chǔ)上,首先通過體外實驗,,明確LBP在細(xì)胞水平上對人肝癌HepG2細(xì)胞生長具有抑制作用,其次通過體內(nèi)實驗,在動物水平上探討LBP單用或者聯(lián)合CXCL10抗實驗性肝癌作用及其具體的免疫學(xué)機(jī)制。
方法:⑴確定LBP對HepG2的抑制效果:將HepG2細(xì)胞混懸液以3500/孔種于96孔板,以200mg/L,4
5、00mg/L800mg/L,1000mg/L四個濃度加藥作用于HepG2,另設(shè)不加藥組對照。以MTT法檢測藥物作用癌細(xì)胞的相對抑制率。⑵LBP聯(lián)合氟尿嘧啶的增敏作用:選用LBP兩個劑量(200mg/L,400mg/L)聯(lián)合5FU(1 umol/L),另設(shè)單藥及不加藥對照組,以MTT法檢測各組藥物作用癌細(xì)胞抑制率,以金氏Q值法評定兩藥協(xié)同或相加效果。⑶建立實驗性肝癌小鼠(H22皮下瘤)模型,隨機(jī)分為腫瘤模型組、LBP(50mg/kg)灌胃
6、組、LBP+CXCL10(50 mg/kg灌胃+右脅皮下注射15ug/kg)組、CXCL10(右脅皮下注射15ug/kg)組、環(huán)磷酰胺(20mg/kg)或氟尿嘧啶(5FU)(12mg/kg)腹腔注射組,每組12只。每天給藥一次,連續(xù)兩周后眼球取血,分離小鼠腫瘤、脾臟、胸腺后稱重,計算腫瘤抑制率、脾臟及胸腺指數(shù)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血Th1/TH2分化情況,ELISA技術(shù)檢測各組小鼠外周血γ-干擾素(IFN-γ)),白介素-4(IL-4
7、)蛋白表達(dá)情況。熒光定量PCR技術(shù)檢測外周血白介素-12(IL-12)及腫瘤壞死因子α(TNF-α) mRNA表達(dá),制作腫瘤組織病理切片,常規(guī)HE染色觀察各組腫瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞密度及淋巴細(xì)胞浸潤情況,免疫組化方法檢測S-100蛋白在腫瘤間質(zhì)浸潤DC的表達(dá)。
結(jié)果:①枸杞多糖對人肝癌細(xì)胞株HepG2的殺傷作用及聯(lián)合氟尿嘧啶增效作用與空白對照組相比較,枸杞多糖在200mg/L,400mg/L800mg/L,1000mg/L的抑制率
8、分別為9.23%,22.80%,36.84%,76.25%,枸杞多糖(200mg/L、400mg/L)聯(lián)合5FU(1umol/L)后的Q值分別為1.12,1.62,為相加和協(xié)同作用。②枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10對H22肝癌小鼠的抑瘤及對免疫器官的影響枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10對肝癌小鼠的腫瘤生長均起到了明顯的抑制作用,與模型組相比,各用藥組腫瘤體質(zhì)量均降低,尤其以LBP、LBP+CXCL10、陽性用藥組(5FU組)效果顯著,各用
9、藥組抑制率分別達(dá)到了55.90%,52.82%,65.58%,且具有統(tǒng)計學(xué)意義; LBP、LBP+CXCL10明顯提高了脾指數(shù),LBP、LBP+CXCL10、CXCL10組胸腺指數(shù)均有上升趨勢,但與模型組比較無統(tǒng)計差異。③枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10對H22肝癌小鼠外周血T輔助細(xì)胞分化結(jié)果枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10組對H22使荷瘤小鼠外周血Th1細(xì)胞增多(由模型組10.61±4.72分別提高至28.38±21.98、24.26±1
10、3.86)而Th2細(xì)胞減少(由模型組21.48±23.23分別減低至7.71±5.24、5.46±2.90)的明顯趨勢,Thl/Th2比率也有所提高,由模型組的0.87±0.42分別上升到6.05±7.83,6.12±3.89。④枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10對H22肝癌小鼠外周血γINF、IL4蛋白表達(dá)的影響與腫瘤模型組相比,枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10能使H22肝癌小鼠外周血INF-γ分別提高至134.26±19.62、129.4
11、4±24.47ng/mL,使外周血IL4分別降低至62.77±8.79、58.10±8.54ng/mL,INF-γ/IL4比值分別提高至2.14±0.10、2.22±0.13,且P均<0.05。⑤枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10對H22肝癌小鼠外周血IL12、TNF-α mRNA表達(dá)與模型組相比,枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10使荷瘤小鼠外周血IL-12mRNA表達(dá)分別上調(diào)了2.94、3.39倍(P<0.05),而TNF-α分別上調(diào)1.55
12、、4.74倍(P<0.05)。⑥枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10對H22肝癌小鼠腫瘤浸潤DC的S-100蛋白表達(dá)影響免疫組織化學(xué)方法檢測S-100蛋白腫瘤浸潤DC的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),與模型組相比,枸杞多糖單用及聯(lián)合CXCL10用藥組S-100DC數(shù)量明顯增多,多表現(xiàn)為高度浸潤,均具統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)
結(jié)論:⑴LBP及LBP+CXCL10可以通過提升荷瘤小鼠的脾臟、胸腺等免疫器官指數(shù),提高機(jī)體整體的免疫功能;⑵LBP及LBP+
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