枸杞多糖抗實(shí)驗(yàn)性肝癌作用的病理定量分析及免疫學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、惡性腫瘤嚴(yán)重危害著人類的身心健康，原發(fā)性肝癌是常見的惡性腫瘤之一，由于肝臟本身的解剖學(xué)和組織學(xué)特征，造成原發(fā)性肝癌極具侵襲性和轉(zhuǎn)移性，多數(shù)肝癌患者就診時(shí)已處于晚期，預(yù)后極差。盡管肝癌的診斷和治療水平在不斷提高，但肝癌的發(fā)病率和死亡率仍居高不下，由于原發(fā)性肝癌外科手術(shù)切除率僅為10％左右，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，各種非手術(shù)療法仍然是原發(fā)性肝癌的主要治療方法，而傳統(tǒng)化療和放療均具有較嚴(yán)重的抑制免疫和造血功能的毒副作用。目前，肝癌治療措施強(qiáng)調(diào)通過(guò)西

2、醫(yī)、中醫(yī)及其他有效的手段和方法相結(jié)合的綜合治療，中醫(yī)藥在預(yù)防肝癌發(fā)生，減少?gòu)?fù)發(fā)，減輕放、化療的毒副作用，提高生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期等方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，隨著醫(yī)藥科技的發(fā)展，中醫(yī)藥治療肝癌的臨床療效在不斷提高，藥物作用機(jī)制的研究也從多方面展開。 文獻(xiàn)報(bào)道，機(jī)體免疫功能低下以及腫瘤自身存在的多種免疫逃逸機(jī)制是引起惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素，如何改善腫瘤機(jī)體免疫功能狀態(tài)和干預(yù)免疫逃逸是目前腫瘤治療主要要解決的問(wèn)題。 資料研究證實(shí)

3、，荷瘤機(jī)體內(nèi)細(xì)胞免疫功能低下，主要表現(xiàn)在CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、而CD8+T淋巴細(xì)胞比例升高，導(dǎo)致CD4+/CD8+比例失常，使腫瘤患者基礎(chǔ)細(xì)胞免疫功能嚴(yán)重障礙。樹突狀細(xì)胞(DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，激活的DC在抗腫瘤免疫應(yīng)答中起著不可替代的作用，但較多資料表明，腫瘤機(jī)體內(nèi)DC表面MHC(主要組織相容性復(fù)合物)-Ⅱ類分子及共刺激分子低表達(dá)，常導(dǎo)致其功能缺陷，因此無(wú)法有效提呈腫瘤抗原，進(jìn)而無(wú)法有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生

4、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)，殺傷腫瘤細(xì)胞，使機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)低下或無(wú)能。有學(xué)者研究認(rèn)為共刺激分子B7表達(dá)降低可能是DC無(wú)法有效激發(fā)CTL反應(yīng)的主要原因。 腫瘤細(xì)胞自身可以通過(guò)多種機(jī)制逃避宿主的免疫監(jiān)視功能，這些機(jī)制包括①Fas和FasL相互作用導(dǎo)致免疫逃逸；②腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生和分泌多種免疫抑制因子；③腫瘤細(xì)胞表面MHCI類抗原缺失或變異等。Fas和FasL相互作用是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。許多腫瘤細(xì)胞均可大量表達(dá)FasL，當(dāng)腫瘤細(xì)

5、胞與活化的Fas(+)的淋巴細(xì)胞接觸時(shí)，通過(guò)傳遞死亡信號(hào)，引起免疫活性細(xì)胞凋亡，而腫瘤細(xì)胞得以存活，從而實(shí)現(xiàn)其免疫逃逸，故又稱為“Fas反擊”。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)FasL表達(dá)陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞可以通過(guò)Fas系統(tǒng)誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡，這可能是導(dǎo)致肝癌組織間質(zhì)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)數(shù)量減少，使肝癌增殖局部產(chǎn)生免疫耐受的原因之一。腫瘤細(xì)胞自身產(chǎn)生或誘導(dǎo)荷瘤機(jī)體產(chǎn)生多種免疫抑制因子如：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、白細(xì)胞介素10(IL-10)、血管內(nèi)皮生

6、長(zhǎng)因子(VEGF)等，可導(dǎo)致免疫效應(yīng)細(xì)胞的增殖、活化受抑；腫瘤細(xì)胞表面MHCI類抗原缺失或變異，使腫瘤細(xì)胞不能為T細(xì)胞所識(shí)別等，這些因素均可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。 臨床與實(shí)驗(yàn)均已證明許多中醫(yī)藥具有肯定的免疫增強(qiáng)和免疫調(diào)節(jié)作用，枸杞多糖(LBP)是補(bǔ)益類中藥中研究較多，療效肯定的中藥之一。研究已證實(shí)LBP有增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能和顯著的抗腫瘤效應(yīng)，它能從調(diào)動(dòng)人體自身的抗病能力出發(fā)，在提高機(jī)體免疫的同時(shí)殺傷腫瘤細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)LBP可促進(jìn)

7、骨髓有核細(xì)胞數(shù)和粒/巨噬細(xì)胞集落數(shù)量的增加(CFU-GM)，而DC與單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等具有共同的祖細(xì)胞，LBP還可誘導(dǎo)體內(nèi)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些因子均有促進(jìn)免疫活性細(xì)胞(包括DC)增殖、分化和成熟的作用，LBP的抗腫瘤作用是否與其對(duì)機(jī)體以及腫瘤局部的免疫效應(yīng)細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞、DC)數(shù)量及功能恢復(fù)有關(guān)?LBP對(duì)腫瘤免疫逃逸機(jī)制是否產(chǎn)生影響?目前鮮見此方面的研究報(bào)道。因此，本研究應(yīng)用H22肝癌細(xì)胞株建立肝癌荷瘤小鼠模

8、型，觀察LBP對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，從LBP對(duì)機(jī)體T淋巴細(xì)胞和DC的影響以及干預(yù)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸角度揭示其抗癌作用的免疫學(xué)機(jī)制。目的：觀察LBP對(duì)H22肝癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，進(jìn)一步探討LBP抗癌作用的免疫學(xué)機(jī)制。 方法：采用H22肝癌荷瘤小鼠模型，LBP分兩個(gè)劑量(LBP0.625g/kg.d-1、1.25g/kg.d-1)連續(xù)灌胃治療兩周，每日測(cè)定腫瘤直徑大小、計(jì)算體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)體積曲線；所有動(dòng)物處死后摘取胸

9、腺及腫瘤并稱其質(zhì)量，計(jì)算胸腺指數(shù)和腫瘤生長(zhǎng)抑制率，并做常規(guī)病理檢查。流式細(xì)胞術(shù)檢查各組外周血、腫瘤間質(zhì)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞(tumor-infiltratinglymphocyte，TIL)中T淋巴細(xì)胞數(shù)量及亞群改變；脾臟DC、腫瘤局部浸潤(rùn)樹突狀細(xì)胞(TIDC)數(shù)量及共刺激分子B7-1(CD80)表達(dá)的變化。采用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)各組血清中VEGF、TGF-β1水平；免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤組織FasL及VEGF表達(dá)情況。在實(shí)驗(yàn)中設(shè)立

10、正常小鼠LBP用藥組，以對(duì)照觀察LBP對(duì)正常小鼠免疫功能的影響。 結(jié)果：1LBP抗實(shí)驗(yàn)性肝癌作用及病理定量分析結(jié)果LBP可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，荷瘤小鼠LBP高、低劑量給藥后，腫瘤生長(zhǎng)體積及平均質(zhì)量均有所減低，在高劑量LBP用藥組與腫瘤模型組間比較有顯著性差異(p＜0.05)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率達(dá)到41.12％。經(jīng)過(guò)病理定量分析發(fā)現(xiàn)LBP對(duì)腫瘤細(xì)胞密度、壞死程度有一定的影響，但評(píng)分后判定未發(fā)現(xiàn)有顯著性差異，而核分裂象計(jì)數(shù)在LBP用

11、藥后明顯下降、并與腫瘤模型組間比較差異有顯著性，LBP不同劑量用藥后，間質(zhì)纖維組織增生及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，并在荷瘤LBP高劑量組與模型組間比較均具顯著性差異(p＜0.05)。 2LBP抗實(shí)驗(yàn)性肝癌的免疫學(xué)機(jī)制研究結(jié)果2.1LBP對(duì)正常小鼠及H22荷瘤小鼠胸腺的影響正常小鼠服用LBP后，小鼠胸腺質(zhì)量有輕度的增加，但與正常對(duì)照組間比較無(wú)顯著性差異。腫瘤模型組小鼠胸腺體積縮小，質(zhì)量普遍減輕，胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù)分別為0.0637±0

12、.0037(g)，3.42±0.19(×10-3)，與正常對(duì)照組及正常用藥組間比較均具顯著性差異，荷瘤LBP低、高劑量用藥后，荷瘤小鼠的胸腺質(zhì)量及指數(shù)均有一定程度的恢復(fù)，在LBP高劑量組與腫瘤模型組比較差異具顯著性(p＜0.05)。 2.3LBP對(duì)小鼠DC細(xì)胞數(shù)量及功能的影響2.3.1LBP對(duì)小鼠脾臟DC細(xì)胞數(shù)量及功能的影響腫瘤模型組及荷瘤LBP高、低劑量用藥組，脾臟單個(gè)核細(xì)胞CD11c+、CD80+及雙陽(yáng)性細(xì)胞比例均較正常對(duì)照

13、組升高，且三組中雙陽(yáng)性細(xì)胞比例與正常對(duì)照組差異均具顯著性：正常用藥組較正常對(duì)照組，以及荷瘤LBP用藥組較腫瘤模型組，CD11c+、CD80+和雙陽(yáng)性細(xì)胞比例亦有所升高，其中，雙陽(yáng)性細(xì)胞比例在荷瘤LBP高劑量組與腫瘤模型組間比較具顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腫瘤生長(zhǎng)體積曲線及抑瘤率、病理形態(tài)學(xué)觀察及定量分析、免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA血清學(xué)等檢測(cè)技術(shù)，觀察了LBP對(duì)H22實(shí)驗(yàn)性肝癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用

14、，并初步探討了其作用機(jī)制及靶點(diǎn)，我們得出以下結(jié)論： LBP對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，表現(xiàn)出明顯的抗移植瘤活性，其抗肝癌作用免疫學(xué)機(jī)制可能為： 1.通過(guò)提高機(jī)體整體的免疫功能、發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。主要表現(xiàn)在：1.1LBP可一定程度提高正常及H22荷瘤小鼠的胸腺質(zhì)量及胸腺指數(shù)；1.2LBP可提高正常小鼠及荷瘤小鼠外周血CD4+細(xì)胞數(shù)量及CD4+/CD8+比值，同時(shí)可以提高荷瘤小鼠腫瘤間質(zhì)中CD4+、CD8+陽(yáng)

15、性細(xì)胞數(shù)量，一定程度恢復(fù)CD4+/CD8+細(xì)胞比值； 1.3LBP對(duì)提高脾臟組織及腫瘤間質(zhì)中DC細(xì)胞數(shù)量，增加B7-1共刺激分子的表達(dá)有一定的作用，但還需進(jìn)一步研究證實(shí)。 2.通過(guò)以下途徑干預(yù)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸機(jī)制，增強(qiáng)抗腫瘤作用： 2.1LBP可下調(diào)腫瘤細(xì)胞表面FasL的表達(dá)，減少腫瘤細(xì)胞對(duì)Fas(+)淋巴細(xì)胞的攻擊，減少免疫活性淋巴細(xì)胞的凋亡； 2.2LBP可降低腫瘤免疫抑制因子VEGF、TGF-β1的