小分子多肽抗實(shí)驗(yàn)性肝癌及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、[目的]觀察小分子多肽CMS024-02抗肝癌的作用，并從細(xì)胞、亞細(xì)胞及分子水平探討其可能的作用機(jī)制。 [方法]應(yīng)用人肝細(xì)胞癌BEL-7402裸鼠移植瘤模型，動(dòng)態(tài)觀察CMS024-02(320，160，80μg/kg/d)對(duì)BEL-7402肝細(xì)胞癌腫瘤體積、瘤重的作用，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般狀態(tài)的影響，以及通過血涂片，骨髓涂片觀察藥物的毒副作用。 以BrdU法、MTT法及LDH法，觀察藥物作用不同時(shí)間后CMS024-02對(duì)腫瘤細(xì)

2、胞分裂增殖、細(xì)胞代謝活力的影響及細(xì)胞毒作用。以β-半乳糖苷酶染色法，觀察CMS024-02誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的作用。以瓊脂糖凝膠電泳觀察藥物對(duì)體外培養(yǎng)BEL-7402細(xì)胞DNA片段化的影響。 采用免疫組化方法，觀察藥物作用后裸鼠移植瘤組織中細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)表達(dá)情況；以原位末端標(biāo)記(TUNEL)法觀察CMS024-02對(duì)裸鼠移植瘤細(xì)胞的促凋亡作用；以病理HE染色、透射電鏡的方法觀察CMS024-02誘導(dǎo)BEL-7402裸鼠

3、移植瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死的作用。 采用原子力顯微鏡觀察CMS024-02對(duì)體外培養(yǎng)BEL-7402細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)的影響；使用美國Affymetrix公司生產(chǎn)的人類基因組寡核苷酸芯片，觀察CMS024-02對(duì)BEL-7402肝細(xì)胞癌基因表達(dá)譜的影響。 應(yīng)用RT-PCR、WesternBlot、免疫組化、ELISA等方法，觀察CMS024-02對(duì)人肝癌BEL7402裸鼠移植瘤PTEN、Akt、MDM2、NF-κB，COX-2

4、、p21、p27、p53基因、蛋白表達(dá)水平及相應(yīng)的酶活性的影響。 [結(jié)果]與生理鹽水對(duì)照組相比，CMS024-02的給藥劑量為320、160μg/kg/d時(shí)，均能顯著抑制裸鼠移植瘤的生長，表現(xiàn)為腫瘤重量、體積減小(p＜0.05)，對(duì)腫瘤的抑制率可分別達(dá)57.60％及58.24％。同20mg/kg/d環(huán)磷酰胺陽性處理組相比，各CMS024-02處理組均能使裸鼠體重顯著性增加，且毛色、皮屑、活動(dòng)狀態(tài)等其它生存狀態(tài)指標(biāo)均優(yōu)于環(huán)磷酰胺組

5、。同時(shí)CMS024-02對(duì)裸鼠骨髓未見明顯抑制作用，對(duì)裸鼠外周血細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)和比例也沒有明顯影響。 CMS024-02能夠抑制體外培養(yǎng)的BEL-7402細(xì)胞DNA合成，降低腫瘤細(xì)胞的代謝活力，并對(duì)其有細(xì)胞毒作用。還能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的BEL-7402細(xì)胞發(fā)生衰老，并可使細(xì)胞DNA發(fā)生片斷化。 CMS024-02作用后，可使BEL-7402裸鼠移植瘤細(xì)胞中PCNA表達(dá)量降低，同時(shí)TUNEL法發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中凋亡細(xì)胞增多。病理

6、HE染色、電鏡觀察也發(fā)現(xiàn)CMS024-02可以誘導(dǎo)BEL-7402肝癌裸鼠移植瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死。 原子力顯微鏡研究結(jié)果顯示：1μg/mLCMS024-02可能造成腫瘤細(xì)胞基因組DNA匯聚；基因芯片分析則發(fā)現(xiàn)，CMS024-02能夠影響B(tài)EL-7402多個(gè)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)水平。 應(yīng)用RT-PCR、WesternBlot、免疫組化、ELISA、酶活性測定等方法發(fā)現(xiàn)，CMS024-02能改變抑癌基因－癌基因間的平衡關(guān)系，

7、造成抑癌基因PTEN、p21、p27mRNA與蛋白表達(dá)增加，但對(duì)p53沒有明顯影響；使癌基因Akt及COX-2mRNA與蛋白表達(dá)減少、MDM2mRNA表達(dá)減少且胞核中的蛋白表達(dá)下降；p-PTEN蛋白表達(dá)減少而p-Akt蛋白表達(dá)增加；PTEN磷酸酶活性增加、Akt激酶活性下降；在對(duì)NF-κBp50及p65亞單位mRNA表達(dá)無影響的狀況下，能顯著抑制其蛋白表達(dá)。 [結(jié)論]CMS024-02能顯著性抑制實(shí)驗(yàn)性人肝癌BEL-7402裸鼠