實驗性顱腦外傷的神經(jīng)保護(hù)及其機(jī)制研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷（traumaitc brain injury，TBI），簡稱顱腦外傷，是神經(jīng)外科領(lǐng)域常見的急癥之一，目前已成為全世界35歲以下青壯年人群死亡和致殘的第一位原因(http://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/statistics.html＃3)。隨著我國國民經(jīng)濟(jì)和交通運(yùn)輸業(yè)等發(fā)展，我國顱腦外傷病例也呈上升趨勢，其中百分之七八十是由交通事故造成，另一個主要原因是工傷意外。目前醫(yī)學(xué)界對顱腦外傷的

2、整體研究尚不深入，也不夠完善，顱腦外傷的基礎(chǔ)研究和臨床防治應(yīng)用研究還很薄弱。目前臨床上尚無一種確切的藥物對腦損傷肯定有效。本論文分別觀測了食物補(bǔ)充OMEGA-3(ω-3)多不飽和脂肪酸以及NKCC1抑制對小鼠顱腦外傷的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　一，食物補(bǔ)充ω-3多不飽和脂肪酸(omega-3 polyunsaturated fattyacid，ω-3 PUFAs)對小鼠顱腦外傷的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　ω-3 PUFAs作為一類重要的

3、不飽和脂肪酸，在腦內(nèi)含量極為豐富，主要分布于神經(jīng)元細(xì)胞膜特別是神經(jīng)突觸前膜上，并且對于維持腦的解剖結(jié)構(gòu)，生化和生理功能的完整性具有極為重要的作用。以往的研究結(jié)果顯示，作為ω-3 PUFAs在成年小鼠創(chuàng)傷性腦損傷中具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制涉及抗凋亡，抗炎癥，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌，減輕神經(jīng)興奮毒性，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生等;后來，James D等人提出ω-3 PUFAs對顱腦外傷后白質(zhì)損傷極有可能具有保護(hù)作用[1]。因

4、此，我們的研究主要目的是:證實ω-3 PUFAs在創(chuàng)傷性腦損傷中的作用，并深入探究ω-3 PUFAs的白質(zhì)損傷修復(fù)的保護(hù)機(jī)制。
　　我們將實驗小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)，對照組(CCI)，干預(yù)組(ω-3 CCI)。采用肌力測試、前肢不對稱測試以及錯步實驗來評測短期和長期運(yùn)動功能，利用水迷宮測試高級認(rèn)知功能（學(xué)習(xí)，記憶能力）。焦油紫染色用來分析計算損傷體積和計算海馬CA3區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)量。Iba1/CD86/CD206免疫組織

5、化學(xué)染色來觀察顱腦外傷后小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況以及M1期，M2期小膠質(zhì)細(xì)胞的分布情況。MBP/SMI32免疫組織化學(xué)染色、western blot、電鏡觀察TBI后損傷周邊區(qū)胼胝體超微結(jié)構(gòu)、電生理檢測TBI后損傷周邊區(qū)胼胝體的動作電位傳導(dǎo)能力等方法來分析顱腦外傷后白質(zhì)損傷修復(fù)情況。同時為了探討神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，我們進(jìn)行體外實驗來研究具體的作用機(jī)制。
　　研究結(jié)果顯示:ω-3 PUFAs雖然不能減少小鼠顱腦外傷后的組織缺失，但卻能明顯改善

6、損傷后長期的小鼠神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)，提高學(xué)習(xí)、記憶能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ω-3 PUFAs組顯著減少損傷后海馬CA3區(qū)神經(jīng)元丟失、抑制損傷后的小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活、減輕外傷后損傷周邊區(qū)的髓鞘脫失，尤其改善損傷周邊區(qū)胼胝體動作電位的傳導(dǎo)。體外實驗中，一方面，DHA預(yù)處理后的少突膠質(zhì)細(xì)胞明顯減輕AMPA誘導(dǎo)的退行性變，提高了存活率;另一方面，DHA預(yù)處理后的小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時，明顯減輕AMPA誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞退行性變，提高了存活

7、率。結(jié)果表明，ω-3 PUFAs家族中的主成員DHA可以通過直接和間接的方式來減輕AMPA對少突膠質(zhì)細(xì)胞的損害。
　　總之，本研究顯示，ω-3 PUFAs能明顯改善顱腦外傷造成的神經(jīng)功能缺失，同時能明顯減輕海馬神經(jīng)元變性壞死，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶功能。本實驗為臨床運(yùn)用ω-3PUFAs防治顱腦外傷，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，提供了重要的實驗依據(jù)。
　　二.NKCC1抑制（抑制劑Bumetanide或NKCC1敲除）對小鼠顱腦外傷的神經(jīng)保護(hù)作用

8、:
　　鈉-鉀-氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體(Na+-K+-2Cl-cotransporter，NKCC)是一類分布廣泛的離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體，包括NKCC1和NKCC2兩種亞型。NKCC1是CNS內(nèi)唯一的NKCC蛋白，表達(dá)在微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的胞體細(xì)胞膜和軸突上，是維持BBB選擇性離子通透性、保持星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)正常離子濃度及細(xì)胞容積，發(fā)揮正常功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。NKCC2主要分布在腎臟髓袢升支粗段的上皮細(xì)胞，參與全身水和電解質(zhì)的

9、代謝[2]。
　　目前研究發(fā)現(xiàn)，NKCC1主要表達(dá)在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中，但是關(guān)于其在TBI中發(fā)揮腦保護(hù)作用的研究較少[3-5]。本實驗通過研究小鼠在TBI后，抑制NKCC1對小鼠腦含水量和神經(jīng)功能改變的影響，以及可能通過保護(hù)血腦屏障和促進(jìn)白質(zhì)損傷修復(fù)而發(fā)揮腦保護(hù)作用的機(jī)制，為NKCC1抑制劑-布美他尼(bumetanide)可能成為潛在的腦保護(hù)劑提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　我們隨機(jī)將野生型實驗小鼠分為假手術(shù)組(sham

10、)，對照組(vehicle)，干預(yù)組(Bumetanide)，同時我們采用NKCC1敲除小鼠進(jìn)一步確認(rèn)NKCC1在顱顱腦外傷中的作用，將基因敲除小鼠分為NKCC1+/+假手術(shù)組(NKCC1+/+ sham)，NKCC1+/-假手術(shù)組(NKCC1+/-sham)，NKCC1+/+手術(shù)組(NKCC1+/+ CCI)，NKCC1+/-手術(shù)組（NKCC1+/-CCI）。采用肌力測試、前肢不對稱測試以及錯步實驗來評測短期和長期感覺運(yùn)動功能。焦油紫

11、染色測定腦缺損體積。伊文斯藍(lán)注入測量其通過血腦屏障通透性并采用免疫組織化學(xué)和western blot分析其緊密連接蛋白、分析腦水腫;同時用電鏡觀察各處理組的血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的破壞情況。MBP/SMI32免疫組織化學(xué)染色、western blot、電鏡觀察TBI周邊區(qū)胼胝體超微結(jié)構(gòu)、電生理檢測TBI周邊區(qū)胼胝體的動作電位傳導(dǎo)能力等方法來分析顱腦外傷后白質(zhì)損傷修復(fù)情況。研究結(jié)果顯示:Bumetanide雖然不能減少小鼠顱腦外傷后的組織缺失，

12、但卻能明顯改善損傷后長期的小鼠神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn);抑制神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中MMP9的表達(dá)和活性，減輕其對血腦屏障緊密連接蛋白的降解，進(jìn)而減輕損傷周邊區(qū)血腦屏障的破壞，保持血腦屏障正常的通透性;抑制外傷后損傷周邊區(qū)的髓鞘脫失和軸突損傷，促進(jìn)髓鞘相關(guān)蛋白的合成，改善損傷周邊區(qū)胼胝體動作電位的傳導(dǎo)，促進(jìn)白質(zhì)損傷修復(fù);上述保護(hù)作用在轉(zhuǎn)基因小鼠身上也得到驗證:相對于NKCC1+/+（野生型）小鼠，NKCC1+/-(NKCC1雜合子型)的小鼠在腦中風(fēng)