神經(jīng)保護(hù)肽[Gly14]-Humanin對腦外傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：Humanin（HN）是2011年新鑒定出的一種神經(jīng)保護(hù)肽，HN能抑制AD相關(guān)因子及疾病誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡。HN的第14位的氨基酸絲氨酸被甘氨酸取代可形成HN衍生物[Gly14]-Humanin（HNG）。研究表明HNG減少缺血/再灌注誘導(dǎo)的腦梗死體積和改善其神經(jīng)功能障礙。本研究中，我們將探索神經(jīng)保護(hù)肽HNG對小鼠創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是否具有保護(hù)作用，并探索HNG的神經(jīng)保護(hù)作用與凋亡

2、及自噬之間的關(guān)系。
　　方法：利用改良的自由落體裝置建立小鼠TBI模型。TBI前15min小鼠側(cè)腦室給予HNG，并于傷后47 h腹腔注射碘化丙啶（propidium iodide，PI），TBI后48 h（PI陽性細(xì)胞出現(xiàn)高峰時(shí)段）處死小鼠，采用體視學(xué)顯微鏡觀察小鼠大腦損傷皮質(zhì)及周邊區(qū)，海馬CA1，CA3及DG區(qū)PI陽性細(xì)胞數(shù)，研究HNG預(yù)處理對TBI引起的神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜完整性破壞的影響。為了探討PI陽性細(xì)胞能否代表腦外傷引起的細(xì)胞

3、丟失，用組織缺損體積（lesion volume，LV）評估TBI后腦組織缺損情況，應(yīng)用行為學(xué)試驗(yàn)（Motor Test和Morris水迷宮試驗(yàn)）評估TBI后各組試驗(yàn)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶功能，探討TBI前15min側(cè)腦室給予HNG及TBI后不同時(shí)間點(diǎn)腹腔給予HNG能否改善腦外傷后神經(jīng)組織損傷及神經(jīng)功能障礙。為了進(jìn)一步探索HNG對TBI的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，采用TBI前15min側(cè)腦室給予HNG，檢測TBI后不同時(shí)間點(diǎn)損傷皮質(zhì)區(qū)及海馬區(qū)激活型c

4、aspase-3及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平，并對凋亡機(jī)制進(jìn)行了深入的探討；同時(shí)檢測HNG對腦外傷后損傷皮質(zhì)區(qū)及海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬激活的影響，并對其作用機(jī)制進(jìn)行探討。
　　結(jié)果：（1）與生理鹽水組對比，HNG側(cè)腦室預(yù)處理（0.1μg）能明顯減少TBI后48 h損傷皮質(zhì)區(qū)及海馬區(qū)（CA1，CA3和DG）PI陽性細(xì)胞。此外，在正常組，假手術(shù)組及損傷對側(cè)半球的皮質(zhì)區(qū)及海馬區(qū)均沒有發(fā)現(xiàn)PI陽性細(xì)胞。（2）與生理鹽水組對比，側(cè)腦室預(yù)給予HNG（0

5、.1μg）在TBI后14d及28d均能明顯減少腦缺損體積，而TBI后1 h或2 h腹腔給予HNG（1μg）仍能減少腦缺損體積，但TBI后4 h腹腔給予同樣劑量HNG不能減少腦缺損體積。（3）TBI前，HNG組與生理鹽水組具有相同的運(yùn)動(dòng)能力。TBI后，與TBI+vehicle組比較，TBI+HNG側(cè)腦室給藥組（0.1μg）能加快運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)（TBI后第1-5d）。然而，TBI后1 h腹腔給予HNG（1μg）只能輕微的加快運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)（

6、TBI后第2-3d）。而傷后2 h和4 h并不能加快運(yùn)動(dòng)的恢復(fù)。（4）TBI前，各組小鼠在定向航行試驗(yàn)，可視平臺(tái)試驗(yàn)及空間探索試驗(yàn)中表現(xiàn)正常的學(xué)習(xí)曲線。HNG側(cè)腦室預(yù)給藥組在 TBI后10-12d尋找平臺(tái)所需時(shí)間明顯比生理鹽水對照組縮短，并且在空間探索試驗(yàn)具有更好的表現(xiàn)。采用HNG腹腔腦外傷后1 h，2 h和4 h單次給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述各個(gè)時(shí)間單次給藥均不能改善小鼠的定向航行試驗(yàn)，傷后1h（傷后2h或4h均不能）給予 HNG能增加小鼠在

7、平臺(tái)所在象限的搜索時(shí)間。（5）免疫印跡分析顯示HNG能逆轉(zhuǎn)TBI誘導(dǎo)的caspase-3和PARP的剪切，Bax的增加和Bcl-2的減少，免疫熒光檢測表明HNG能減少損傷皮質(zhì)區(qū)及海馬CA1，CA3及DG的caspase-3陽性細(xì)胞（TBI后48 h）。進(jìn)一步研究HNG的抗凋亡機(jī)制發(fā)現(xiàn)，HNG能通過抑制內(nèi)外源性兩條凋亡途徑而抑制TBI誘導(dǎo)的凋亡激活。（6）與生理鹽水組對比，HNG能抑制TBI誘導(dǎo)的自噬的激活，即抑制LC3II，Beclin