pEGFP-c1-pprI真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其抗放作用的研究.pdf

1、目的:耐輻射球菌是一種對(duì)電離輻射、紫外線(xiàn)(UV)照射、干燥以及DNA損傷試劑都具有非常強(qiáng)的抗性,且不會(huì)引起自身致死或突變的奇特微生物。pprI基因是耐輻射球菌發(fā)揮輻射抗性、修復(fù)DNA損傷的關(guān)鍵調(diào)控基因,它作為一個(gè)分子開(kāi)關(guān),在受到電離輻射的刺激后上調(diào)表達(dá),并可以通過(guò)調(diào)節(jié)recA和pprA的表達(dá),來(lái)修復(fù)DNA損傷促進(jìn)菌株的存活,此外pprI還可以調(diào)節(jié)耐輻射球菌的抗氧化、基因表達(dá)和代謝等能力,增強(qiáng)菌株的電離輻射抗性。本實(shí)驗(yàn)旨在研究耐輻射球菌p

2、prI原核基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染對(duì)離體真核細(xì)胞和哺乳動(dòng)物急性放射損傷的防護(hù)作用。
　　材料與方法:以本室保存的pCMV-HA-pprI質(zhì)粒為模板,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,通過(guò)DNA重組技術(shù)構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體 pEGFP-c1-pprI,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入人肺上皮細(xì)胞株(BEAS-2B),篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞以便觀(guān)察其抗放作用。應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)受照細(xì)胞生存能力;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率;熒光顯微鏡觀(guān)察受照細(xì)胞中

3、ROS熒光強(qiáng)度;免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀(guān)察受照細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)γH2A.x焦點(diǎn)數(shù)目。同時(shí),將重組質(zhì)粒pEGFP-c1-pprI通過(guò)活體電轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)入BALB/c小鼠股后肌中,轉(zhuǎn)染后24 h給予4Gyγ射線(xiàn)照射,觀(guān)察小鼠急性放射損傷的死亡率;觀(guān)察小鼠照后1、7、14、28和35d小鼠外周血細(xì)胞數(shù)目和淋巴細(xì)胞百分率以及肺臟、小腸、睪丸等組織的病理變化;應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠脾臟細(xì)胞、胸腺細(xì)胞和骨髓細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了pprI原核基因

4、的真核表達(dá)載體,并在293T細(xì)胞中表達(dá)了PprI融合蛋白,將其轉(zhuǎn)染到人肺上皮細(xì)胞系中,篩選出了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。輻射細(xì)胞生存曲線(xiàn)顯示,與BEAS-2B細(xì)胞對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)pprI基因的BEAS-2B細(xì)胞經(jīng)不同劑量輻射,其細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)SF顯著增加(P<0.05),該曲線(xiàn)參數(shù)D0、Dq、N值顯著增高。轉(zhuǎn)pprI基因BEAS-2B細(xì)胞受照后ROS熒光強(qiáng)度和不同時(shí)間γH2A.X的焦點(diǎn)數(shù)均顯著減低(P<0.05);該細(xì)胞G2期阻滯和凋亡

5、率顯著減低(P<0.05)。γ射線(xiàn)照射后,pprI基因轉(zhuǎn)染組小鼠死亡率顯著低于單純照射組和空載體轉(zhuǎn)染組;由血象觀(guān)察結(jié)果可見(jiàn),pprI基因轉(zhuǎn)染組小鼠外周血白細(xì)胞、血小板和淋巴細(xì)胞百分率顯著高于單純照射組和空載體轉(zhuǎn)染組(P<0.05);由凋亡率檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn),pprI基因轉(zhuǎn)染組的小鼠的脾臟、胸腺、骨髓細(xì)胞的凋亡率顯著低于單純照射組和空載體轉(zhuǎn)染組(P<0.05),與外周血的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)一致;由病理圖片可見(jiàn),pprI基因轉(zhuǎn)染組小鼠組織臟器損傷較輕

6、,恢復(fù)快于單純照射組和空載體轉(zhuǎn)染組。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了pprI原核基因的真核表達(dá)載體pEGFP-c1-pprI;pprI基因能夠在真核細(xì)胞和哺乳動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)PprI蛋白。
　　2.成功篩選pprI基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞,pprI可降低受照細(xì)胞ROS含量,減少DNA雙鏈斷裂,進(jìn)而降低細(xì)胞凋亡率并減少細(xì)胞周期阻滯,加快細(xì)胞的修復(fù),提高細(xì)胞的生存力。
　　3.pprI基因活體轉(zhuǎn)染可降低致死劑量受照小鼠的死亡率,顯著

7、減輕受照小鼠外周血細(xì)胞的下降程度,且可使淋巴細(xì)胞恢復(fù)提前。
　　4.pprI基因活體轉(zhuǎn)染可以降低受照小鼠的脾臟、胸腺和骨髓細(xì)胞凋亡率。
　　5.pprI基因活體轉(zhuǎn)染可減輕受照小鼠肺臟、腸道和睪丸的組織臟器的病理反應(yīng),加快受損組織的修復(fù)。
　　綜上所述,pprI原核基因可在離體真核細(xì)胞和哺乳動(dòng)物體內(nèi)表達(dá),對(duì)細(xì)胞和動(dòng)物急性放射損傷具有顯著的抗放作用。本研究為進(jìn)一步闡明耐輻射球菌 pprI基因?qū)κ苷照婧思?xì)胞和哺乳動(dòng)物的作用及