ALR-EGFP真核表達(dá)載體的構(gòu)建、在大鼠體內(nèi)的表達(dá)及其抗肝損傷作用的實驗研究.pdf

1、目的：肝再生增強因子(ALR)是從新生大鼠肝組織中克隆到的一種肝增殖刺激因子，能特異地刺激肝細(xì)胞增殖，是肝再生的重要調(diào)控因子，能提高中毒性肝損傷動物的存活率，在肝損傷修復(fù)過程中發(fā)揮作用。本研究擬構(gòu)建ALR與增強型綠色熒光蛋白(EGFP)融合蛋白真核細(xì)胞表達(dá)載體，將GFP基因作為標(biāo)記基因，以基因治療的方式，觀察ALR基因給予CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠后，綠色熒光蛋白在肝組織和其它組織內(nèi)的表達(dá)情況，肝組織病理及肝損傷的恢復(fù)情況等，探討ALR基

2、因?qū)毙愿螕p傷的保護作用，以期為ALR臨床救治急性肝病提供理論依據(jù)和新的治療方法。 方法：以本室保存的質(zhì)粒pBV-220-ALR為模板，用合成的引物進(jìn)行PCR擴增，擴增條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30sec，50℃退火20sec，72℃延伸10sec，30個循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)低熔點瓊脂糖凝膠回收純化，并經(jīng)EcoRⅠ及SalⅠ雙酶切后，與相同酶切的真核高效表達(dá)載體pEGFP-C2進(jìn)行體外定向

3、重組，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α。于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基篩選重組子，對陽性重組子進(jìn)行酶切鑒定和測序。測序使用Sanger雙脫氧末端中止法。鑒定正確后，進(jìn)行重組質(zhì)粒的大量抽提并純化，紫外分光光度計測OD260定量。取大鼠48只，按2ml/kg腹腔注射50％CCl4(1體積CCl4:1體積豆油)，進(jìn)行肝損傷模型的建造。四小時后，按不同注射劑量，不同注射途徑，不同時間點等，隨機分為8組。具體分組如下：第一組：模型組；第二組：肌肉

4、注射pEGFP-C2-ALR，50μg/kg；第三組：肌肉注射pEGFP-C2-ALR，100μg/kg；第四組：肌肉注射pEGFP-C2-ALR，200μg/kg；第五組：靜脈注射pEGFP-C2-ALR，200μg/kg；第六組：腹腔注射pEGFP-C2-ALR，200μg/kg；第七組：肌肉注射pEGFP-C2-ALR，200μg/kg；第八組：肌肉注射pEGFP-C2-ALR，200μg/kg。2～6組每12小時注射一次，共注射

5、4次，末次注射后12h斷頭處死動物；7～8組每12小時注射一次，共注射4次，分別在末次注射后24、60小時后處死動物。另取4只大鼠為正常對照組。動物處死后，于肝右葉固定部位取肝組織，同時取腎組織，做冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察各組的熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況。同時取肝右葉組織，做石蠟切片，行HE染色，進(jìn)行肝組織病理學(xué)檢查，并對肝的損傷恢復(fù)情況進(jìn)行鑒定。計量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差((-x)±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析(ANOVA

6、)，兩兩比較采用LSD檢驗。等級資料采用秩和檢驗。所有數(shù)據(jù)均利用SPSS11.5軟件包分析。 結(jié)果：構(gòu)建的pEGFP-C2-ALR重組質(zhì)粒目的基因與文獻(xiàn)報道的大鼠ALRcDNA編碼區(qū)序列相同；大量制備的重組質(zhì)粒pEGFP-C2-ALR，提純后再次經(jīng)酶切鑒定，除可見預(yù)期的特異性條帶外，未見其他的非特異性條帶，紫外分光光度計測定OD260/OD280：pEGFP-C2-ALR為1.9；熒光顯微鏡下觀察各組的熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況

7、，各ALR治療組均在肝組織內(nèi)有數(shù)量不等的熒光細(xì)胞出現(xiàn)，而且表達(dá)的融合蛋白較均勻的分布于整個細(xì)胞，表明ALR基因進(jìn)入到肝細(xì)胞并獲得了有效表達(dá)。結(jié)果表明200μg/kgALR較50μg/kg、100μg/kgALR的熒光細(xì)胞多，熒光蛋白表達(dá)量大；ALR不同注射途徑熒光蛋白表達(dá)量為肌肉注射＞靜脈注射＞腹腔注射；不同時間點的熒光蛋白表達(dá)量為末次注射后24小時＞末次注射后12小時＞末次注射后60小時；而在腎組織未發(fā)現(xiàn)有熒光蛋白的表達(dá)。光學(xué)顯微鏡下

8、觀察經(jīng)HE染色的石蠟切片，以肝損傷的分級標(biāo)準(zhǔn)為診斷依據(jù)。結(jié)果為，各ALR治療組均不同程度地減輕CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠肝組織病理損害。具體為200μg/kgALR較50μg/kg、100μg/kgALR恢復(fù)效果好；ALR不同注射途徑恢復(fù)效果依次為肌肉注射＞靜脈注射＞腹腔注射；不同時間點的恢復(fù)效果為末次注射后60小時＞末次注射后24小時＞末次注射后12小時。 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了ALR-EGFP哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，并在大鼠肝