雙抗蟲基因共轉(zhuǎn)化四倍體菘藍的研究.pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文雙抗蟲基因共轉(zhuǎn)化四倍體菘藍的研究姓名：王凱申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生藥學(xué)指導(dǎo)教師：張漢明丁如賢20050401第u二軍醫(yī)人學(xué)碩士學(xué)位論文摘要摘要構(gòu)建以CaMV35S為啟動子，同時帶有蘇云金芽孢桿菌殺蟲結(jié)晶蛋白基因(Cry刷)和半夏凝集素基因(P砌)的質(zhì)粒載體p3300CrylApta，導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHAl05株系作為基因工程菌。優(yōu)化菘藍lsatisindigoticaFort組織培養(yǎng)條件，子葉和下胚軸直接再生芽

2、的最佳激素配比為BA2mg／LNAA05mg／L。通過草丁膦(phosphinothricin，PPT)濃度梯度篩選，考察菘藍外植體的敏感濃度，結(jié)果表明PPT5me：／L是轉(zhuǎn)化菘藍合適的選擇壓。以子葉和下胚軸為外植體，采用葉盤法轉(zhuǎn)化菘藍，并以未轉(zhuǎn)化的外植體作為陰性對照，獲得了菘藍再生抗性植株，子葉再生頻率467％，下胚軸再生頻率243％。在生根培養(yǎng)階段，NAAO2mg，L為最佳激素濃度。PCR檢測再生抗性植株，雙基因轉(zhuǎn)化陽性率為325％

3、。陽性轉(zhuǎn)化植株在目標(biāo)位置(CryIA：680bp和pta：804bp)均出現(xiàn)特征條帶，而對照在相應(yīng)位置未出現(xiàn)條帶，初步表明外源基因已轉(zhuǎn)入菘藍基因組。選取3株P(guān)CR陽性株進行Southern雜交分析，結(jié)果顯示外源CrylA和pta已經(jīng)整合進入菘藍基因組并都呈單一拷貝。建立轉(zhuǎn)基因陽性植株快速擴繁體系，葉片和葉柄直接再生芽最佳激素配比為BAO2mg／LNAA002mg／L，再生苗的陽性率為867％。轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過馴化，一周后即可移栽，移栽存活

4、率達到925％。采用鱗翅目的小菜蛾P(guān)lutetlaxylostellaLinne和同翅目的桃蚜Myzusper時icaeSulzer作為受試?yán)ハx，考察轉(zhuǎn)6，和pta菘藍的抗蟲性。兩周后統(tǒng)計，平均剩余葉面積比為852％(鱗翅目小菜蝶)，平均蚜口密度抑制率為358％(同翅目桃蚜)，與未轉(zhuǎn)基因菘藍相比，轉(zhuǎn)基因菘藍具有明顯提高的抗小菜蝶和桃蚜活性fPO05)，轉(zhuǎn)基因前后HPLC圖譜相似度達到O910。關(guān)鍵詞：四倍體菘藍：根癌農(nóng)桿菌：轉(zhuǎn)基因；半夏