靶向超聲造影評價兔腹主動脈粥樣硬化的實驗研究.pdf

1、靶向超聲造影評價免腹主動脈粥樣硬化的實驗研究目的 整合ICAM-1單克隆抗體及自制含氟烷人血白蛋白超聲造影劑，制備攜抗ICAM-1的白蛋白靶向超聲造影劑，探討超聲造影劑的靶向制備技術(shù)；建立動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)早期血管內(nèi)皮功能損傷的動物模型以及腹主動脈粥樣硬化的模型，評價攜抗ICAM-1的超聲造影劑在動脈粥樣硬化(AS)早期診斷中的靶向價值和意義，為靶向超聲造影劑的制備及其在外周血管疾病中的臨床應(yīng)用

2、進行基礎(chǔ)實驗研究。 資料與方法 1.靶向超聲造影劑的制備 將自制含氟烷人血白蛋白超聲造影劑與小鼠ICAM-1單克隆抗體1：1混合，而后按一定比例與濃度加入戊二醛，置于4℃冰箱孵育2h，促使抗體與微泡外殼充分交聯(lián)。微泡與抗體交聯(lián)反應(yīng)后，以PBS洗滌、離心，分層，去除下層未結(jié)合的游離抗體，取上層懸浮液，即得攜抗ICAM-1的白蛋白靶向超聲造影劑。使用血細胞記數(shù)儀檢測靶向造影劑微泡的濃度，普通光鏡下評估靶向微泡的大小、

3、形態(tài)。另取少量現(xiàn)制的攜抗ICAM-1的白蛋白靶向造影劑及普通含氟烷人血白蛋白造影劑，分別與等量異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的山羊抗小鼠IgG混合，恒溫孵育30min，PBS洗滌、離心、分層后取上浮液，在熒光顯微鏡下觀察兩種造影劑微泡外殼各自的熒光染色情況。以靶向超聲造影劑微泡外殼發(fā)明亮綠色熒光而普通白蛋白造影劑微泡外殼無熒光顯示為標準，鑒定ICAM-1單克隆抗體與含氟烷人血白蛋白造影

4、劑整合成功。 2.研究對象及實驗方法 (1)新西蘭大白兔16只，高脂喂飼4周建立腹主動脈內(nèi)皮功能損傷的動物模型后，實驗對象隨機分為兩組，分別經(jīng)兔耳緣靜脈推注普通含氟烷人血白蛋白超聲造影劑(第1組)和攜抗ICAM-1的白蛋白靶向超聲造影劑(第2組)，普通、靶向造影劑的使用劑量均為0.02ml/kg。高脂喂飼前及喂飼4周末，超聲造影觀察普通、靶向兩種白蛋白微泡在正常兔腹主動脈內(nèi)膜及ICAM-1過度表達的損傷血管內(nèi)膜的顯影情況

5、，并對兩組的超聲造影結(jié)果做統(tǒng)計學比較分析。高脂喂飼4周末，超聲造影后處死動物，取兩組兔腹主動脈標本，標本分做兩份備用。一部分標本用2.5％戊二醛固定，透射電鏡評價血管內(nèi)皮細胞的超微結(jié)構(gòu)改變；掃描電鏡下觀察白蛋白造影劑在損傷血管內(nèi)皮細胞表面的黏附、結(jié)合情況，并比較普通、靶向兩種白蛋白造影劑在損傷血管內(nèi)皮細胞表面黏附程度的差異；另一部分標本做成厚度8μm的冷凍組織切片，加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗人血白蛋白單克隆抗體工作液50μl

6、，恒溫孵育30min，采用免疫熒光技術(shù)檢測普通、靶向兩種白蛋白造影劑在兔腹主動脈損傷內(nèi)膜組織中的分布情況，熒光顯微鏡下觀察并比較兩組動物腹主動脈內(nèi)膜組織熒光染色程度的差異。 (2)新西蘭大白兔26只，高脂喂飼12周建立腹主動脈粥樣硬化的動物模型后，把實驗對象隨機分做三組，第1、2組實驗兔分別使用普通、靶向造影劑行腹主動脈超聲造影，第3組實驗兔同時應(yīng)用兩種造影劑造影。普通、靶向造影劑的使用劑量均為0.02ml/kg。對三組實驗對象

7、的超聲造影結(jié)果做統(tǒng)計學比較分析，定量評估各組對象造影前、后血管內(nèi)膜及粥樣硬化斑塊灰階視頻密度值的改變，比較普通、靶向兩種白蛋白造影劑在改善血管內(nèi)膜、粥樣硬化斑塊灰階顯像中的不同作用。超聲造影后處死第1、2組實驗對象，取兔腹主動脈標本，標本分三份。一部分標本用10％福爾馬林固定、包埋做HE染色常規(guī)病理切片，光鏡下觀察腹主動脈粥樣硬化的病理組織學特征；另一部分標本做成石蠟組織切片，在組織切片上依次加入鼠抗人血白蛋白單克隆抗體以及辣根過氧化物

8、酶標記的山羊抗小鼠IgG孵育、洗滌后，光鏡下觀察普通、靶向兩種白蛋白造影劑在腹主動脈炎癥血管壁中的免疫組化染色結(jié)果；還有一部分標本做成厚度8μm的冷凍組織切片，加入FITC標記的抗人血白蛋白單克隆抗體工作液50μl，恒溫孵育30min后，在熒光顯微鏡下觀察并比較兩種白蛋白造影劑在腹主動脈炎癥血管壁中的免疫熒光染色結(jié)果。 結(jié)論 1.制備靶向超聲造影劑的關(guān)鍵是將靶向配體連接到微泡壁上。本研究根據(jù)白蛋白微泡的成膜材料特征和單克

9、隆抗體的化學性質(zhì)，采用戊二醛交聯(lián)法將ICAM-1單克隆抗體整合于白蛋白造影劑微泡外殼，成功制備出攜抗ICAM-1的含氟烷人血白蛋白靶向超聲造影劑，方法簡便、成本低、重復性好，具有較好的應(yīng)用前景。 2.由于ICAM-1在正常組織中幾乎不表達，所以攜抗ICAM-1的造影劑微泡在正常血管內(nèi)膜結(jié)合很少。而在動脈粥樣硬化形成區(qū)，攜抗ICAM-1的造影劑微泡可靶向黏附于ICAM-1過度表達的損傷血管內(nèi)膜。靶向超聲造影可據(jù)此識別動脈粥樣硬化早