復(fù)合抗腫瘤活性珊瑚羥基磷灰石人工骨的研制及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、復(fù)合抗腫瘤活性珊瑚羥基磷灰石人工骨的制備及緩釋實(shí)驗(yàn) 為研究抗腫瘤藥物順鉑(cis-diamminedichloroplatinum，CDDP)載入后其在CHA的分布，復(fù)合順鉑后CHA作為緩釋載體對CDDP的體內(nèi)外緩釋作用。 方法： l、將CHA浸入0.6mg/ml的順鉑磷酸鹽溶液中快速振蕩30s后負(fù)壓靜置24h，取出CHA利用低溫冷凍干燥凍干。分別將0.5g、0.2g、0.1g順鉑用1ml二甲基亞砜(dime

2、thyl sulphoxide，DMSO)配成溶液后，再加入上述人工骨后再低溫凍干。掃描電鏡分析復(fù)合人工骨斷面的孔隙及順鉑的分布情況，用能譜分析了解人工骨內(nèi)部所復(fù)合順鉑的含量。 2、以復(fù)合20％順鉑的CCHA為實(shí)驗(yàn)對象，將CCHA樣本避光浸入10mmo/L的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PB)中37℃、30轉(zhuǎn)/分浸泡振蕩，每2天更換10ml磷酸鹽緩沖液。 3、利用3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)將SD大

3、鼠麻醉后，經(jīng)手術(shù)將100mg CCHA顆粒經(jīng)手術(shù)植入SD大鼠背部肌袋中，術(shù)后定期取材時行大體觀察、X線攝片檢查，觀察動物重要臟器的一般情況，材料及周圍組織有無感染等不良反應(yīng)，取動物靜脈血和復(fù)合人工骨植入處周圍l cm及1cm-2cm范圍的肌肉組織勻漿后檢測順鉑含量。 4、利用高效液相色譜法檢測體外緩釋試驗(yàn)浸提液、體內(nèi)緩釋試驗(yàn)肌肉組織及血液中順鉑的濃度。 結(jié)果顯示： l、順鉑在CHA孔隙內(nèi)分布均勻，CHA的孔隙結(jié)構(gòu)

4、未改變； 2、利用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測體外浸提液、動物靜脈血及組織勻漿液中的順鉑濃度結(jié)果示順鉑和內(nèi)標(biāo)液的保留時間分別為4.6 min和7.5 min，兩者分離效果良好。 3、體外緩釋液中前2周順鉑出現(xiàn)快速釋放，體外浸提液中順鉑的濃度極高(2周時濃度為753.01±64.89)；至12周其順鉑濃度仍達(dá)到134.54±9.88μg/ml。

5、 4、動物植入CCHA后局部較長時間內(nèi)可維持較高順鉑濃度，隨著時間的延長及與人工骨的距離增加局部的順鉑濃度呈下降趨勢，距離人工骨1cm-2cm內(nèi)的的順鉑濃度低于人工骨周圍1cmm組織內(nèi)順鉑濃度，除7d時兩組間比較無顯著性差異外(P=0.06)，其余時間兩者間比較存在顯著性差異。 5、CCHA植入后動物血液中順鉑的濃度穩(wěn)定在較低水平，平均不超過17μg/ml，遠(yuǎn)低于體內(nèi)緩釋試驗(yàn)中局部組織中的順鉑濃度。 6、動物各重

6、要臟器大體及組織切片示CCHA植入后對動物機(jī)體無不良影響。小結(jié)：CCHA具有良好的緩釋效能，可在局部維持一定時間高藥物濃度。 小結(jié)：CCHA具有良好的緩釋效能，可在局部維持一定時間高藥物濃度。 二、復(fù)合人工骨體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究 CCHA作為抗腫瘤人工骨的體外抑制腫瘤細(xì)胞作用，為進(jìn)一步行體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。為了使CCHA更加適合臨床相關(guān)骨腫瘤的應(yīng)用，我們首先從臨床取得明確診斷為骨巨細(xì)胞瘤及乳腺

7、腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，成功獲取骨巨細(xì)胞瘤及骨轉(zhuǎn)移乳腺腺癌原代培養(yǎng)瘤細(xì)胞，通過對原代培養(yǎng)瘤細(xì)胞進(jìn)行光鏡、電鏡下形態(tài)學(xué)觀察并與國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相比較，原代培養(yǎng)細(xì)胞離心后行常規(guī)病理切片HE染色、免疫組織/細(xì)胞化學(xué)檢測及接種于裸鼠建立腫瘤模型后取得的瘤結(jié)節(jié)組織切片HE染色與臨床組織標(biāo)本的病理切片進(jìn)行對比，對瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定，確定實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞為所需的瘤細(xì)胞。再明確成功獲取上述兩種腫瘤原代培養(yǎng)瘤細(xì)胞基礎(chǔ)上選用四肢常見骨惡性腫瘤一骨肉瘤

8、細(xì)胞株U-2OS，脊柱轉(zhuǎn)移瘤中其他最常見的腫瘤．人高轉(zhuǎn)移性肺腺癌細(xì)胞株SPCA-1、前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞株P(guān)C-3、人高轉(zhuǎn)移性結(jié)腸腺癌細(xì)胞株LOVO細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對象。將第一部分實(shí)驗(yàn)所得的CCHA及CHA體外緩釋液凍干粉再用與其凍干前相同體積的培養(yǎng)基溶解后作用于培養(yǎng)的瘤細(xì)胞，其中CHA的體外緩釋液為對照組，光鏡下觀察浸提液對瘤細(xì)胞的作用情況，并利用四唑鹽(MTT)比色法檢測其對上述細(xì)胞的抑制率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照CHA組浸提液對瘤細(xì)胞生長沒有明

9、顯的抑制作用，再次說明自制的CHA具有良好的生物相容性；實(shí)驗(yàn)CCHA組8周內(nèi)不同時間的浸提液對上述6種瘤細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，加入浸提液后各系瘤細(xì)胞生長均受到不同程度的抑制，細(xì)胞皺縮，部分細(xì)胞崩解死亡；MTT結(jié)果顯示乳腺腺癌原代培養(yǎng)細(xì)胞、肺腺癌SPCA-1、骨肉瘤細(xì)胞株U-2OS及結(jié)腸腺癌LOVO細(xì)胞株對CCHA浸提液較敏感，8周內(nèi)浸提液的抑制率均超過50％。 小結(jié)：CCHA在體外對多系骨相關(guān)腫瘤細(xì)胞具有良好的抑制作用。

10、 三、復(fù)合人工骨體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn) 進(jìn)一步研究在體內(nèi)狀態(tài)下CCHA人工骨的抗腫瘤活性。利用骨巨細(xì)胞瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞株U-2OS、肺癌細(xì)胞株SPCA-1、前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3、結(jié)腸腺癌LOVO細(xì)胞株及乳腺癌原代培養(yǎng)瘤細(xì)胞接種于裸鼠建立腫瘤模型，結(jié)果示骨巨細(xì)胞瘤成瘤率較低且瘤結(jié)節(jié)生長較慢，本實(shí)驗(yàn)中共20個接種點(diǎn)僅成瘤4個瘤結(jié)節(jié)。乳腺癌腫瘤模型未建立成功，其余腫瘤成瘤率較高，其中肺癌及結(jié)腸腺癌瘤結(jié)節(jié)生長較快。在瘤結(jié)節(jié)成瘤

11、后10天，經(jīng)手術(shù)將實(shí)驗(yàn)組CCHA及對照組CHA人工骨顆粒嵌入裸鼠腫瘤模型的瘤結(jié)節(jié)內(nèi)，予相同條件下培養(yǎng)，觀察動物在人工骨植入前后的一般活動、局部傷口、瘤結(jié)節(jié)大小等情況，術(shù)后10天處死取材，再觀察裸鼠心臟、肝臟、腎臟及肺等重要臟器的顏色、大小及行組織切片常規(guī)H-E染色了解人工骨植入是否對裸鼠機(jī)體存在損傷作用，是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等情況。比較對照組及實(shí)驗(yàn)組人工骨植入前后瘤結(jié)節(jié)體積大小的變化，切取、制作并比較兩組已植入人工骨瘤結(jié)節(jié)的脫鈣H-E染色組

12、織切片以了解CcHA體內(nèi)對腫瘤的抑制情況。結(jié)果示：骨巨細(xì)胞瘤模型中兩處瘤結(jié)節(jié)植入CCHA后，瘤結(jié)節(jié)出現(xiàn)明顯縮小并逐漸出現(xiàn)包括局部小塊皮膚在內(nèi)的干性壞死，對照組植入CHA后瘤結(jié)節(jié)無明顯變化。肺癌腫瘤模型在裸鼠接種瘤細(xì)胞后4-7天于頸背部或前臂腋窩處及后背部出現(xiàn)腫塊，并迅速膨大。成瘤后10天行人工骨植入前腫瘤結(jié)節(jié)平均體積為735.67±116.11mm<'3>。人工骨植入后可見對照CHA組裸鼠腫瘤呈現(xiàn)惡性持續(xù)增長。實(shí)驗(yàn)組CCt{A植入后腫瘤

13、出現(xiàn)明顯生長抑制，腫瘤體積減小，部分瘤結(jié)節(jié)及局部皮肢出現(xiàn)干性壞死，瘤結(jié)節(jié)取材時平均體積為132.13±51.10mm<'3>，與對照CHA植入組(取材時平均體積為4564.33±320.03mm<'3>)相比有顯著性差異(P=0.001)。 小結(jié)：CCHA在體內(nèi)對多系骨相關(guān)腫瘤細(xì)胞具有良好的抑制作用。 四、復(fù)合人工骨體內(nèi)成骨實(shí)驗(yàn) 由于所有化療藥物對機(jī)體的作用存有兩面性，CCHA所復(fù)合的藥物量較大，植入體內(nèi)后局部藥

14、物濃度較高，對可能殘留的腫瘤細(xì)胞有殺傷作用的同時對正常的周圍組織也存在一定的殺傷作用，其植入骨缺損后可能影響骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)及骨生長的作用，從而無法與周圍骨缺損形成骨愈合。為了進(jìn)一步研究自制CHA在體內(nèi)的降解和新骨替代行為以及CCHA植入體內(nèi)后能否起到骨支架、骨傳導(dǎo)及骨生長的作用，與骨缺損之間形成骨愈合，為將來CCHA的進(jìn)一步改進(jìn)及用于修復(fù)骨缺損的研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)組及對照組，經(jīng)手術(shù)分別將CCHA及CHA人工骨植入兔股骨兩干

15、骺端的骨缺損模型中，術(shù)后定期行大體觀察、兩股骨X線片及取材行組織切片，觀察材料降解和被新骨替代的速度、骨與材料界面的結(jié)合情況，材料內(nèi)部新骨生長情況。結(jié)果示：術(shù)后動物一般情況良好，傷口愈合良好，無不良并發(fā)癥；CHA植入后比CCHA較快與周圍骨形成組織及骨橋連接，植入4周后X線片影像示CHA邊緣開始逐漸不清，組織切片顯示周圍早期有疏松結(jié)締組織長入材料孔隙內(nèi)，緊貼材料孔壁富含成骨細(xì)胞且逐漸有類骨質(zhì)及骨細(xì)胞形成，材料周邊及中央?yún)^(qū)多處出現(xiàn)新骨質(zhì)生

16、長并逐漸連接融合替代材料形成骨小梁，且與動物骨形成骨愈合。CCHA植入后早期約8周內(nèi)局部以抑制組織細(xì)胞生長為主，6周至12周逐漸有組織結(jié)構(gòu)向材料孔隙內(nèi)生長且逐漸出現(xiàn)成骨細(xì)胞、骨基質(zhì)及骨細(xì)胞，新生骨逐漸生長替代融合，于26周左右與周圍骨形成骨愈合，28周左右材料周邊及中央?yún)^(qū)的成骨情況基本跟對照組CHA植入一致，說明CCHA植入早期雖對骨愈合有一定的抑制作用，但最終仍可自行與周圍骨缺損達(dá)到骨愈合。 小結(jié)：CCHA在體內(nèi)與CHA一樣具