四個(gè)云南軟米水稻品種低值鏈淀粉含量形成機(jī)制研究.pdf

1、本研究選用四個(gè)云南軟米品種毫屁、毫皮、毫木細(xì)和毫安悶，探索其低直鏈淀粉含量形成機(jī)制，試圖為優(yōu)質(zhì)軟米分子育種提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： 1．根據(jù)水稻全基因組序列信息設(shè)計(jì)引物，利用overlapping PCR方法，并對(duì)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，獲得毫屁Wx約7kb的基因組序列，序列分析結(jié)果為：?jiǎn)?dòng)子具有Wx<'a>啟動(dòng)子的特點(diǎn)，即第一內(nèi)含子5’端剪接位點(diǎn)為AG/GT，可以被充分剪接，且該位點(diǎn)上游(CT)<,n>處有10個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)，

2、與稻米的高直鏈淀粉含量高度相關(guān)；編碼區(qū)在第四外顯子(+497個(gè))處存在一個(gè)單堿基突變(堿基A突變?yōu)镚)，編碼子由GAC突變?yōu)镚GC，導(dǎo)致了天門(mén)冬氨酸突變?yōu)楦拾彼帷Ｅc前人研究相比，毫屁中控制低直鏈淀粉含量的基因是一個(gè)新Wx復(fù)等位基因，命名為WX<'hp>。 根據(jù)第四外顯子的單核苷酸突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)dCAPs標(biāo)記，利用該標(biāo)記檢測(cè)另外三個(gè)云南軟米，毫皮、毫木細(xì)和毫安悶。這些品種的Wx基因在該位點(diǎn)的基因型和Wx<'hp>相同。利用和毫屁相同

3、的方法獲得這些品種的Wx基因組序列，其Wx基因也都在第四外顯子處存在一個(gè)單核苷酸突變，驗(yàn)證了dCAPs標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果。 2．分別提取毫屁、日本晴和南京11抽穗14天胚乳GBSSI進(jìn)行SDS-PAGE分析。日本晴胚乳GBSSI積累量明顯低于南京11胚乳GBSSI積累量，這與前人研究結(jié)果一致。另外，毫屁胚乳中GBSSI積累量和酶活性都顯著低于日本晴，表明毫屁胚乳中積累較少GBSSI蛋白，并伴隨著GBSSI活性減弱。 3．分別提

4、取毫屁、日本晴和南京11抽穗14天胚乳RNA，用兩對(duì)引物primerRT-1和primerRT-2作半定量RT-PCR。毫屁、日本晴和南京11胚乳中Wx基因表達(dá)的前體mRNA量相同，其中Wx<'hp>基因的轉(zhuǎn)錄本只形成一種2.3kb的成熟mRNA，表明其具有Wx<'a>啟動(dòng)子功能的特點(diǎn)。 另外，利用帶有質(zhì)粒p1301：：WX<'hp>和p1301：：Wx<'b>的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻愈傷，潮霉素篩選一個(gè)月后獲得抗性愈傷，分別檢測(cè)GUS

5、活性。Wx<'hp>啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS活性顯著高于WX<'b>基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS活性，表明Wx<'hp>啟動(dòng)子具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄能力。 4．對(duì)Wx<'b>基因進(jìn)行原核表達(dá)分析。提取水稻胚乳RNA，利用RT-PCR方法得到WX<'hp>全長(zhǎng)cDNA，將其構(gòu)建到大腸桿菌表達(dá)載體pET30a(+)中，轉(zhuǎn)化BL21，獲得含有Wx<'hp>全長(zhǎng)cDNA的重組工程菌。經(jīng)包涵體蛋白變性和復(fù)性后，測(cè)定pET：：Wx<'hp>表達(dá)的融合蛋白催化活

6、性。以pET：Wx<'b>表達(dá)的融合蛋白活性為對(duì)照，兩者的催化活性沒(méi)有顯著差異，表明Wx<'hp>存在的一個(gè)單核苷酸突變沒(méi)有影響到Wx<'hp>蛋白活性。 5．為了通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗(yàn)證WX<'hp>中單核苷酸突變對(duì)該基因功能的影響，分別構(gòu)建了CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的WX<'hp>全長(zhǎng)cDNA正義表達(dá)載體pPZ：：WX<'hp>和對(duì)照質(zhì)粒pPZ：：Wx<'b>，為進(jìn)一步轉(zhuǎn)化水稻的研究奠定基礎(chǔ)。 6．利用掃描電鏡，對(duì)四個(gè)云