16937.云南藥用野生稻(oryzaofficinaliswall.exwatt.)大片段dna“滲入系”構建研究

1、云南大學博士學位論文云南藥用野生稻（yzaofficinalisWall.exWatt.)大片段DNA“滲入系”構建研究姓名：劉艷平申請學位級別：博士專業(yè)：發(fā)育生物學指導教師：黃興奇201210混合克隆池逐級進行篩選，確定了3個攜帶Xa21抗病基因片段的陽性克隆。表明孟定藥用野生稻可能攜帶Xa21抗白葉枯病基因，進一步研究仍在進行中。4、藥用野生稻大片段DNA轉(zhuǎn)化栽培稻。分別提取14個三級混合克隆池的質(zhì)粒DNA，分別通過電擊轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌

2、LBA4404感受態(tài)細胞中。統(tǒng)計每個三級混合池質(zhì)粒DNA經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化獲得的農(nóng)桿菌克隆數(shù)并保存。每次將30個左右攜帶有藥用野生稻大片段DNA的農(nóng)桿菌克隆混合，分別轉(zhuǎn)化具有代表性的栽培稻品種日本晴(Nipponbare)、中花11、滇隴201、9311的成熟胚誘導的愈傷組織，共培養(yǎng)25d后，將愈傷轉(zhuǎn)移到含有50pg／ml潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，篩選6—8周，獲得的抗性愈傷組織經(jīng)過預分化和分化成苗，得到一批抗性苗。其中，第7混合池混合大片段DNA

3、轉(zhuǎn)化獲得211株日本晴抗性苗；第8混合池混合大片段DNA轉(zhuǎn)化獲得189株日本晴抗性苗，176株中花11抗性苗；第11混合池混合大片段DNA轉(zhuǎn)化獲得13株9311抗性苗。5、轉(zhuǎn)基因水稻植株分子檢測，獲得“滲入系刀。分別提取第7、8、1l混合池所對應的抗性苗基因組DNA，用潮霉素(hpt)基因引物和新霉素(nptlI)基因引物分別進行PCR檢測。結果顯示：日本晴抗性苗中，66％(264／400)的植株含潮霉素(hpt)基因，98％(39／4

4、00)的植株含潮霉素(hpt)基因和新霉素(nptII)基因；中花11抗性苗中，642％(113／176)的植株含潮霉素(hpt)基因，85％(15／176)的植株含潮霉素(hpt)基因和新霉素(nptlI)基因；13株9311抗性苗未檢測出潮霉素(細r)基因和新霉素(nptII)基因。藥用野生稻混合大片段DNA在日本晴、中花11中的轉(zhuǎn)化率分別為44％、42％。以BIBAC載體上TDNA區(qū)中SacB基因57端和nptll基因57端序列設

5、計引物，對轉(zhuǎn)化獲得的含助f和nptII基因的日本晴、中花11轉(zhuǎn)基因苗基因組DNA進行PCR檢測，結果進一步證實了藥用野生稻大片段DNA已整合進日本晴、中花11基因組中。結果表明：已獲得了54(3915)株攜帶藥用野生稻大片段DNA的日本晴和中花11“滲入系”。目前，進一步的鑒定研究仍在進行中。本研究篩選獲得了3個攜帶Xa21抗病基因序列的陽性克??；初步建立了云南藥用野生稻大片段DNA“滲入系”構建的技術體系；獲得了54株攜帶藥用野生稻大