似鲇高原鰍傳染性潰瘍癥病原學研究.pdf

1、2014年2～3月，四川樂山某似鲇高原鰍養(yǎng)殖場暴發(fā)一種流行性傳染病，死亡率達30％，主要臨床特征為體表褪色，皮膚多處潰瘍，腹部出血，鰓絲充血、腫脹與斷裂等。為明確其病因，本研究在病理學檢查的基礎上，開展了病原學的研究?；疾◆~剖檢見血色腹水，肝臟腫大，可見壞死灶，腸腔內(nèi)見淡黃色粘液，腦膜充血、出血，脾與腎腫大。組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)，皮膚壞死，肌間隙增寬、水腫，肌細胞變性、壞死、溶解;心肌出血;鰓上皮細胞腫脹、脫落，部分鰓小片增生連成板狀;脾

2、淋巴細胞數(shù)量減少，含鐵血黃素沉著;腎間造血組織壞死、出血，炎癥細胞浸潤，腎小管上皮細胞變性、壞死;肝索結(jié)構(gòu)紊亂，中央靜脈淤血，肝細胞變性，灶性壞死;腦膜水腫，腦基質(zhì)疏松呈“海綿狀”，神經(jīng)細胞腫脹，核固縮，小膠質(zhì)細胞增生。
　　取病魚的鰓、體表粘液和潰瘍壞死物涂片鏡檢，未發(fā)現(xiàn)寄生蟲與真菌。肝、腎和脾觸片后革蘭氏染色，鏡檢也未發(fā)現(xiàn)細菌。無菌條件下，取病魚的肝、腎和脾組織分別劃線接種LB平板和BHI平板，28℃恒溫培養(yǎng)48 h，未見細菌

3、生長。將病魚的肝、腎和脾組織研磨過濾菌后接種到鯉魚上皮瘤細胞(epitheliomapapulossum of carp，EPC)，盲傳3代出現(xiàn)壞死，脫落，形成空斑等典型細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)，收集細胞液，離心，取上清液繼續(xù)接種EPC細胞，分離到一株病毒。將分離病毒液分別腹腔和肌肉注射20尾健康似鲇高原鰍，試驗魚出現(xiàn)與自然發(fā)病魚相同的癥狀而對照組無異常，證實分離病毒為該病的病原。取細胞病毒液電鏡下觀察

4、，發(fā)現(xiàn)病毒顆粒呈單個或多個晶格狀排列分布，單個病毒顆粒為正六邊形，對稱20面體，對角線直徑約103±7 nm，與虹彩病毒顆粒形態(tài)相似。分離病毒在EPC細胞中增殖，其TCID50值能達到105.4/0.1mL，用BrdU處理分離病毒，病毒滴度下降了4.4個單位，病毒分別經(jīng)過乙醚、酸、堿、胰蛋白酶和熱處理后，其TCID50均下降2個單位以上，表明病毒粒子具有囊膜，對酸、堿、熱和胰蛋白酶敏感。合成一對虹彩病毒主要衣殼蛋白(maiorcapsi

5、dprotein，MCP)基因的引物(5'-GAC TTG GCC ACT TAT GAC-3'，5'-GTCTCT GGA GAA GAA GAA-3')，對出現(xiàn)CPE的細胞及自然發(fā)病魚的內(nèi)臟器官進行PCR檢測，均能擴增出約500bp的特異性條帶，擴增產(chǎn)物測序后在GenBank中進行NCBI-Blast比對，發(fā)現(xiàn)擴增序列與蛙病毒屬病毒的同源性最高，達97％以上。
　　為進一步明確分離病毒的分類地位，分別設計蛙病毒MCP、DNAp

6、ol、RNR-α和RNR-β基因的4對引物對分離病毒的相應基因進行PCR擴增、T-克隆、測序及系統(tǒng)發(fā)育分析。在基于以上4個基因序列與GenBank中部分同源性較高的序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，分離病毒與中國大鯢蛙病毒(Chinese giant salamandervirus CGSV)、蘇黎世側(cè)褶蛙蛙病毒(Zuerich pelophylax collection ranavirus，ZPCR)、梭鱸虹彩病毒(Pike-perch iri