17906.雙歧桿菌原生質(zhì)體的制備及serpin缺失株的構建

1、學位論文獨創(chuàng)性聲明學位論文獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得南昌大學或其他教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名(手寫)：幸膃弓抖＼簽字日期：刀膨年么月留日學位論文版權使用授權書本學位論文作者

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3、IIIIlY2141610Serpin(serineproteaseinhibitor)是一種多肽類絲氨酸蛋白酶抑制劑的總稱，由350至500個氨基酸組成。2006年研究發(fā)現(xiàn)長雙歧桿菌的菌體表面存在著Serpin，能夠保護菌體抵抗外源蛋白酶的消化，為其粘附定植腸道提供前提條件。目前，Serpin蛋白對雙歧桿菌物質(zhì)代謝，繁殖擴增等方面的影響不甚清楚。在前期研究中，本實驗室篩選到一株產(chǎn)Serpin蛋白的嬰兒雙歧桿菌，證實原核克隆表達的Ser

4、pin蛋白能有效抑制糜蛋白酶和胰彈性蛋白酶的活性，并促進雙歧桿菌體外粘附細胞；本研究擬通過導入置換型打靶載體，構建基因缺失株的方法，進一步研究表面蛋白Serpin的功能。然而由于雙歧桿菌的細胞壁過厚，外源基因?qū)肜щy，導致轉(zhuǎn)化效率極其低下，因此本研究一方面要獲得高活力的雙歧桿菌原生質(zhì)體，另一方面通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及同源重組獲得serpin基因缺失株。雙歧桿菌原生質(zhì)體制備的文獻報道甚少，本文分別評價了多種因素(生長狀態(tài)、酶解濃度、時長、溫度

5、以及不同滲透壓穩(wěn)定劑等)對長雙歧桿菌原生質(zhì)體制備的影響，獲得了長雙歧桿菌WBL001原生質(zhì)體制備及再生的優(yōu)化條件：菌體處于對數(shù)中期(OD600為20)，以棉子糖溶液(SMM)為原生質(zhì)體穩(wěn)定液，5mg／L變?nèi)芫兀?7℃孵育30min，原生質(zhì)體生成率和再生率分別達到81％和48％0，目前報道中革蘭氏陽性菌的原生質(zhì)體再生率在30％左右。在此基礎上，通過原生質(zhì)體的PEG介導轉(zhuǎn)化，將構建的雙歧桿菌serpin的置換型打靶載體UPD導入雙歧桿菌，